细胞表面抗原的检测-间接免疫荧光法SOP

cao1976

【试剂】
（1）一抗和荧光标记的二抗
（2）固定液：如4%多聚甲醛、乙醇等。
（3）洗涤液及抗体稀释液(pH 7.4 PBS-Tween 20)
【操作方法】
（1）取已固定好的细胞爬片或甩片或经过预处理的组织切片（石蜡或冰冻切片）；
（2）加入25ml一抗，完全盖住盖玻片，室温孵育60min；注意不可使盖玻片接触培养板孔边缘。每个检测应包括3组对照：与一抗同一种属、类型的无关抗体组，以检测染色的特异性；未加一抗的对照组，以检测二抗染色的背景；如果可能，用已知阳性样品作为阳性对照组。
（3）加入标记FITC标记的抗抗体（二抗）25ml，室温孵育20min；标记二抗在使用前，应预试其合适的稀释度；
（4）用洗涤液洗3次，各5min；
（5）在一干净和作好标记的载玻片上滴一滴封固液（约50ml）。用一尖头镊子将盖玻片取出。将盖玻片边缘置于一干净纸巾上蘸干液体。翻转盖玻片，使细胞面朝下，置于封固液上，慢慢放下盖玻片，与载玻片相邻与封固液的一端接触，然后使盖玻片置于封固液上，这样可赶出气泡。在观察前空气干燥30min；
（6）在荧光显微镜下观察、拍照

细胞内抗原的检测-间接免疫荧光法

     细胞内抗原的检测过程与细胞表面抗原检测过程基本一致，只是在与一抗孵育前，需要预先对细胞用非离子去污剂进行透化处理。
【操作方法】
（1）取已固定好的细胞爬片或甩片或经过预处理的组织切片（石蜡或冰冻切片）；
（2）用含0.2%TritonX-100或NP-40的PBS溶液透化固定后的细胞2min（室温），有些标本可能需要长达15min，时间视抗原而定；
（3）余下步骤接上述“细胞表面抗原的检测-间接免疫荧光法”步骤（2）；
【注意事项】
（1）在使用前，一抗二抗均应测试其合适的稀释度。
（2）多聚甲醛的固定是不稳定的，标本经多聚甲醛固定后，应再用去污剂处理，如果标本在水溶液中浸泡的时间过长，则会使交联结构解体。因此，应避免固定后的标本在水溶液中浸泡的时间过长。
（3）信号微弱的解决方法：
①提高一抗和二抗的浓度以增强敏感性 ，这必须测试各种浓度抗体的滴度；
②延长一抗和二抗的孵育时间。由于细胞染色时抗原吸附在固相载体上，抗原抗体结合时间较在溶液中长。孵育时间可因实验设计作适当调整，但少于20min抗体和抗原几乎不能有效结合。在以上两点中，应摸索出一个最佳条件以产生有效信号且保持良好的背景。这就需要反复试验，因为每组抗体和抗原的情况会有所不同；
③改变检测方法，用共聚焦显微镜观察，可提高敏感性。
（4）背景不好的解决方法
    细胞样本进行荧光染色时，背景问题主要来自两个方面，即非特异性染色和特异性交叉反应。
    ①非特异性吸附：非特异性吸附背景问题的产生与抗原抗体的特异性结合无关。即一抗或二抗与样品相互作用而发生吸附，而不是与抗原发生特异性结合。
    *将所有抗体溶液或含蛋白的检测试剂用100，000´g离心30min以去除蛋白聚合物。
    *滴定一抗和所用的检测试剂，以确定能够产生合适信号的最低浓度。
    *固定后，用饱和量并不被检测试剂结合的非特异性抗体封闭样品，有效的封闭液包括5%的与标记二抗来源相同的同种血清、3%的BSA和3%的脱脂奶粉。
    *用上述封闭液稀释抗体和检测试剂。
    *固定后，在所有的缓冲液及洗涤液中加入2%吐温-20。
    *缩短一抗或标记试剂的孵育时间。
    *充分洗涤（延长洗涤时间，重复次数）。
    *改变检测方法。
    ②特异性背景：造成特异性背景问题的原因有三种因素，即污染抗体所致假阳性、交叉反应和样品中含有能与Ig结合的蛋白质。
    *如用多克隆抗体，应滴定抗体（假阳性）。
    *如用多克隆抗体，亲和纯化特异性抗体（假阳性）。
    *如用多克隆抗体，用适当的丙酮肝脏粉吸收以阻抑假阳性。
*换用其他抗体（交叉反应及假阳性）。