[讨论交流] 实验 植物病毒的接种与传染

donggua

jbclinic
发表于 2010-5-24 09:52
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1.目的要求 植物病毒不能主动侵入寄主，但病毒病仍然十分普遍，这是与病毒侵染的机制和传播的有效性密切相关的。实验室中常用病株汁液作为人工接种的材料，可有效地将大多数病毒接种到试验材料上。但有些病毒则不能用汁液接种，必须用介体来传染，例如昆虫介体等，它们以不同的方式来传播病毒。不同的病毒有不同的传播方式，因此这也是病毒鉴定时的重要性状之一。 　　通过人工摩擦接种，学习常规的汁液接种法和关键技术，通过对一套鉴别寄主的接种，了解鉴别寄主的鉴别作用，筛选作用和定量作用。 　　通过蚜虫或叶蝉的传毒实验，学习利用介体传播病毒的技术，从而加深对介体作用的认识。 　　有些病毒材料在研磨过程中易被氧化而钝化，因此还要加入少量的缓冲液，常用的是0.01M的磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2)，有时还加有Na2SO4或巯基乙醇(0.1％)(Mercapioethanol)，抗坏血酸等还原剂以保护病毒。 　　2．材料和用具 植物病毒标样1号，2号，3号，4—5叶期的心叶烟，普通烟、苋色藜、千日红、蚕豆和莱豆苗等，幼苗生长健壮，无 病虫害。 　　肥皂或肥皂水，消毒的研钵与研棒，洗瓶，金刚砂或硅藻土(600目)，0.05MpH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)，塑料标签，铅笔，小毛笔，养虫笼，养虫罩，拟除虫菊酯，喷雾器、指形管、塑料封口膜，洗瓶。蚜虫(必须是不带任何病毒的健康的无翅蚜，尽量不用有翅蚜)：桃赤蚜(Myzuspersicae)；豆蚜(A．crassivora)和甘蓝蚜(Brevcorgne brassicae)等。 　　3．内容与方法 　　本帖隐藏的内容需要回复才可以浏览3．1人工摩擦接种 　　(1)因为每个人的手指甲和手指上都可能污染有多种病毒，因此在做实验之前都应先用肥皂水洗手，将病毒钝化和洗除干净，以防污染。 　　(2)供试植物叶面如有污物泥沙，应先用自来水冲洗干净，晾干后均匀地撒上摩擦．剂(金刚砂或硅藻土)。 　　(3)剪取小块病毒病样本的叶片放在研钵中，加入少量磷酸盐缓冲液，研碎成糨状。 　　(4)用食指或研棒蘸取少量病叶汁液，在供接种的植物叶面轻抹2—3次，注意摩擦要轻，不要来回擦，应单向地从叶基向叶尖方向抹，接种叶用手掌或手指托住，不要用力过大，更不能弄破叶片。 　　(5)接种后即可用洗瓶将叶面的病汁液和摩擦剂冲洗干净。注意：一定要将摩擦剂冲洗掉，否则将影响日后的症状观察(图9)。 　　(6)用铅笔在接种过的叶片尖端刺一小孔作为接补叶的记号。 　　(7)各组要用一盆植物作空白对照，即用缓冲液代替病R1汁液做接种。 　　(8)用铅笔写好标签后插入花盆中，标签要注明：病毒标样代号，寄主符号，接种日期和接种者。例如T1，心叶烟， 日／月， 张／刘。 　　(9)接过种的植物要放在有光照的温室中培养，每2—3天观察记载一次发病情况，尤其要注意接种叶和新叶上的症状是否相同? 　　(10)为了提高接种的成功率，通常将待接种的植物幼苗放在黑暗处8—10小时后再接种。 　　(11)症状记载的常用符号：枯斑：11：坏死：Nl褪绿；Ch，斑驳；Mo，花叶：M，环斑：RS，脉明，Vc蕨 叶：F。 　　如连续三次观察的结果是：　　(1)接种叶枯斑，新叶无症状可记为II／一 　　　　　　　　　　　　　　　　(2)接种叶枯斑，新叶褪绿可记为ll／ch 　　　　　　　　　　　　　　　　(3)接种叶枯斑，新叶花叶可记为1l／M 　　3．2 蚜虫饲毒接种 能传播病毒的媒介物很多，以刺吸式口器的昆虫为主，其次是真菌等。 　　(1)从隔离的养虫笼中收集无翅蚜，用振落法使蚜虫跌落到大培养皿或白磁盘中，用毛笔沾取蚜虫收集在指形管或三角瓶中，纱布封口，在20℃左右温箱中饥饿4—6小时。 　　(2)将病毒病叶摘下放在大培养皿中。 　　(3)取出饥饿的蚜虫，抖落在病叶上，蚜虫稍经爬行后立即停住取食(头朝下，尾部朝上)．也可将蚜虫直接挑放在病株上饲毒。 　　(4)经取食5—10分钟或特定的时间后，用毛笔轻触蚜虫的尾部，使蚜虫拔出口针，然后用毛笔将蚜虫挑起，移放到待接种植株的心叶上，并用养虫罩罩住；也可将蚜虫挑放在特制的接虫纱罩(图10)中，然后将纱罩夹在供接种植株上部嫩叶的背面。植株放在温室中培养。 　　(5)24小时后喷撒杀虫剂杀死蚜虫，移去养虫罩或接虫纱罩。 　　(6)植物放在温室中培养。 　　(7)定期观察记载接种和新叶上的症状o 　　4.实验时间 3学时。 　　5.作业与思考题 　　(1)列表记载接种毒源在各鉴别寄主上的症状及发病过程，查阅有关资料，分析核对你接种样本可能是哪一种病毒? 　　(2)为何一定要先洗手，后接种? 　　(3)如何测定病毒／蚜虫是持久性传播还是非持久性传播(提出试验方案来)? 　　(4)为何要用缓冲液?为何要有作空白对照的植株? 　　(5)有些病毒人工接种不发病，可能有哪些原因?