佐剂的研究进展

zhaox

“Adjuvant”,即佐剂,最早来源于希腊语“adjuvare”,也就是帮助的意思[1]。随着DNA重组疫苗、合成肽疫苗等新型疫苗不断涌现,免疫佐剂研究越来越受到人们的关注.近年来佐剂的发展迅猛,多种新型佐剂层出不穷,人们对佐剂的作用机理亦有更深入的认识.
佐剂的概念及发展简史
佐剂（Adjuvants）是先于抗原或与抗原同时应用，能非特异性地改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答，能增强相应抗原的免疫原性或改变免疫反应类型，而本身并无抗原性的物质，又称免疫佐剂或抗原佐剂。佐剂被用来增强疫苗的免疫反应已有近80年的历史，1925年法国兽医免疫学家Ranmon发现疫苗中某些物质的佐剂作用，1926年Glenny证明明矾具有佐剂作用，1951年Freund研制成弗氏佐剂。目前我国对蜂胶佐剂、油乳佐剂、核酸佐剂、细胞因子佐剂等新型佐剂的研究也有迅速发展。 1

免疫佐剂的功能
佐剂可选择性地改变免疫应答的类型，产生体液和\或细胞免疫。如：弗氏完全佐剂（FCA）是细胞免疫的强刺激剂，也能刺激体液免疫；弗氏不完全佐剂（FIA）仅能刺激体液免疫。改变体液抗体的种类IgG亚类和抗体的亲和性，如壳聚糖、氧化甘露聚糖。佐剂还可改变抗原的构型，使疫苗诱导T辅助细胞和细胞毒T淋巴细胞(CHL)反应。如免疫刺激复合物。佐剂可改变免疫反应为MHCⅠ型或MHCⅡ型。如：白细胞介素4（IL-4）能上调MHCⅠ类抗原, IL-1可诱导MHCⅡ类反应。佐剂还能改变T辅助细胞(Th1和Th2)的免疫反应。FCA可诱导Th1型细胞因子，IL-18、IL-12也可强烈诱导Th1型细胞因子产生;FIA则是典型的只诱导Th2型细胞因子。

2 免疫佐剂的分类
目前,经动物实验证实有佐剂作用的物质多达百种以上,按佐剂作用可将其分为2类:①贮存型佐剂,即能以吸附成其他方式粘着抗原物质,注入机体后,可使抗原存留在一定的接种部位,并逐渐往周围释放,以延长抗原的作用时间,如铝佐剂。②中枢作用型佐剂,即能与抗原一起直接对免疫细胞呈现刺激或激活作用,如细菌内毒素、卡介苗等。按佐剂性质也可将其分为2类1)微生物及其亚细胞成分。(2)非微生物类成分:①不溶性铝盐胶体;②油脂类包括福氏完全佐剂(CFA)和不完全佐剂(IFA);③植物提取物;④生化佐剂和细胞因子。

3 免疫佐剂作用机理
佐剂增强免疫应答的机制尚未完全阐明，其作用机制包括：①在接种部位形成抗原贮存库，使抗原缓慢释放，延长抗原在局部组织内的滞留时间，较长时间使抗原与免疫细胞接触并激发对抗原的应答。②增加抗原表面积，提高抗原的免疫原性，辅助抗原暴露并将能刺激特异性免疫应答的抗原表位递呈给免疫细胞。③促进局部的炎症反应，增强吞噬细胞的活性，促进免疫细胞的增殖与分化，诱导细胞因子的分泌。

4 几种常用的佐剂  4. 1 铝佐剂   铝佐剂[2]（aluminum-containing adjuvants）包括：氧化铝佐剂（aluminum hydroxide adjuvant）和磷酸铝佐剂（aluminum phosphate adjuvant）两种。在使用过程中氢氧化铝以其本身的特点而使用更加广泛.A1(OH)3成本低、使用方便，是兽医生物制品生产中应用最广的一种佐剂，也是至今被美国食品和药物管理局(FDA)批准第一个用于人类疫苗的佐剂。在化学上氢氧化铝佐剂是以铝羟基形式存在的，其羟基可以提供或接受质子，从而表现为两性化合物。磷酸铝佐剂不是单一的物质，而是羟基磷酸铝复合物，磷酸基团对羟基地置换程度取决于反应物和沉淀的条件及其等电点，商品磷酸铝佐剂的等电点是5.0，在pH7.4的溶液中成阴离子形式存在，是阳离子抗原的良好吸附剂。
铝佐剂是目前应用最为广泛的一类佐剂,已批准的含铝佐剂疫苗包括DTP、无细胞百日咳疫苗DTP (DTaP)、b型流感杆菌(HIB)疫苗(不是所有的)、乙型肝炎(HB)疫苗,以及所有的DTaP、HIB或HB的联合疫苗.还包括甲型肝炎疫苗、莱姆病疫苗、炭疽疫苗和狂犬病疫苗. 铝盐佐剂的问题是注射部位有轻度局部反应，形成肉芽肿，甚至发生局部无菌性脓肿；可能对人、畜神经系统有影响；与弗氏完全佐剂(FCA)相比，铝盐佐剂在注射部位缓慢释放抗原物质的效应要弱得多，因而活性要比FCA低。

4. 2 弗氏佐剂
弗氏佐剂,即乳化的水油佐剂,分为弗氏完全佐剂(FCA)和弗氏不完全佐剂(FIA)。FCA是标准的诱生体液和细胞免疫佐剂,可诱导Th1型细胞因子;FIA则是典型的只诱导Th2型细胞因子,诱生抗体的佐剂。除少数兽用疫苗使用FIA (如口蹄疫疫苗)外,很少用于动物免疫。 4.2.1 FIA 是一种将低引力和低黏度的矿物油与乳化剂以3～5∶1的比例混合，用时再与抗原等体积混合制成的贮藏型佐剂，借助乳化剂制成油包水佐剂，充分乳化后，116℃灭菌30 min即成。其作用与铝佐剂相似，不能诱发很强的细胞免疫，也不能诱发迟发型超敏反应 4.2.2 FCA
是在FIA基础上加一定量分枝杆菌或卡介苗制成。每毫克FIA加入死分枝杆菌或卡介苗2～3mg。虽然FCA尚有一定副作用，但其高度佐剂活性是其他物质难于比拟的。其作用机制是特异性刺激T细胞功能，增强机体对胸腺依赖性抗原的应答，还可引起迟发型超敏反应，促进细胞免疫等，但它有黏稠，能造成组织损伤等缺点，还可能有致癌作用。
4. 3 细胞因子 大量理论和实践证明，细胞因子对免疫应答的产生和调节具有重要作用。细胞因子一方面调节机体的特异性免疫反应，另一方面增强机体的非特异性免疫反应，并诱导机体产生有效的免疫保护力，尤其是对免疫力低下个体具有十分重要的意义[3]。
细胞因子是免疫反应的强调节剂,作为佐剂的细胞因子包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、INF-γ、GM-CSF、TNF-α、TNF-β、TCA-3等。实验资料显示GM-CSF、IL-12或IL-15等细胞因子可以大大增加基因疫苗的免疫效果,共同注
射基因疫苗和细胞因子表达质粒,其诱导产生的免疫反应高于单独使用基因疫苗组[4] 。链球菌引发的肺炎是呼吸系统疾病的主要病原,一种肺炎多糖交联疫苗对婴幼儿的保护率只有50%~60%,用IL-12作为该疫苗佐剂,经3种肺炎病毒感染后,接种疫苗的小鼠存活率约为75%,未接种疫苗的对照组存活率为0[5]。可见细胞因子对免疫应答的产生和调节具有重要作用。 白细胞介素2（IL-2）  可引起T细胞增殖和维持T细胞在体外的持续增长，顾曾成为T细胞生长因子（TCGF）。同时IL-2可作用于多种免疫细胞，包括T、B淋巴细胞、巨噬细胞和NK细胞等，对免疫应答具有广泛的上调作用。IL-2也是迄今为止研究的最为透彻的细胞因子。
4. 4 脂质体
脂质体(Liposome)是单层磷脂或由数层可溶性物质隔开的呈同心圆状排列的连续多层磷脂所组成的脂质小囊,内含水相空间.它既是抗原载体,也是免疫佐剂. 由于其膜结构致密，抗原不易漏出，能长久的将抗原传递给免疫细胞，促进抗原对抗原提呈细胞的定向作用。LIP既无毒性，又无免疫原性以及在体内的可降解性，不会在体内引起类似弗氏佐剂所引起的损伤，是一种优良佐剂。刘湘涛等报道用LIP与禽多杀性巴氏杆菌的主要保护性抗原荚膜多糖（CPS）配制的疫苗比用油乳剂、明矾及金黄色葡萄球菌免疫复合物为佐剂的效果好。Novasomes是目前研制的一种新型脂质体样系统用于黏膜免疫，该系统为非磷脂亲水脂分子，在体内稳定性比常规LIP好，而且价廉、易制备，是一种很好的免疫佐剂[6]。
4.5天然来源佐剂
蜂胶(Propolis) 是蜜蜂从植物中采集的树脂、花粉等与蜂蜡及蜜蜂上颚腺分泌物形成的芳香性胶状物。内含几十种生物活性物质、多种维生素、氨基酸、脂肪酸、多糖及酶等,具有广谱抗病毒、抗细菌、抗霉菌和抗氧化作用。配合抗原注入机体,能刺激免疫机制和丙种球蛋白活性,可增强补体功能、增强免疫功能细胞及吞噬细胞数量,促进抗体产生,从而增强免疫功能[7]。
4. 6 Toll样受体
    Toll样受体[8] (Toll-like recepters,TLRs)是与果蝇Toll蛋白具有同源性的表达于细胞膜上与免疫系统识别微生物有关的一类受体家族,能够识别特定类型微生物的保守的分子成分,即病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),如TLR4识别脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),而TLR3识别病毒感染过程中产生的双链RNA,从而激活信号转导途径、诱导炎症反应、促进抗原提呈细胞的活化,导致天然免疫反应来抵抗微生物感染。1997年Medzhitov等首次发现了人类的第一种Toll同源变体(即TLR4),后又发现了至少9种人的TLR家族蛋白,分别被命名为TLR1-10。加拿大Coley制药公司的Davis在HIV患者中证实,以CpG基序为骨架的TLR配体能与肝炎疫苗联用,在对该疫苗不敏感的患者中,可明显增强免疫应答。有证据证实,单链RNA可能是TLR7的天然配体。瑞士OM制药公司的Davies开发了一系列新型TLR4配体(如OM-174),这些配体是革兰阴性菌黏多糖骨架的三酰类似物[9]。

4.7 目前热门研究的免疫增强剂
4.7.1 MF59佐剂 MF59佐剂由4.3 %角鲨烷、0·5 %吐温-80和0.5 %Span85组成。MF59不但可以刺激体液免疫,还可激发细胞免疫。在抗原中加入MF59佐剂的疫苗有很多种,如猿猴和人艾滋病病毒、疱疹病毒等,制成的疫苗常为O/ W型[7]。到目前为止MF59是已被美国FDA批准成为除铝佐剂外第二个上市的人用佐剂。例如Chiron公司的流感疫苗已上市并进入中国市场,乙肝、丙肝及HIV亚单位抗原等也用其作为佐剂进行了大规模的临床实验[ 10、11]。
4.7.2 壳聚糖(chitosan,CTS)是甲壳类动物(如虾、蟹)、昆虫和其它无脊椎动物外壳中的甲壳质(chitin)经脱乙酰化制得的一种天然高分子多糖体,可溶于酸性介质而不能溶于水,对其进行化学修饰,可改善其溶解性,从而发挥特殊功效。医学界将其誉为继糖、蛋白质、脂肪、维生素、矿物质(无机盐)之后人体必需的第六生命要素。由于壳聚糖具有很好的生物相容性,而且无毒,易生物降解,因此其在医药、食品、日用化妆品、环保、农业等领域具有广泛的应用前景[12]。 许多研究表明壳聚糖可有效促进局部(特别是黏膜局部)的免疫反应,增强抗原传递系统功能,具有免疫佐剂的效应。Bacon[13]等将壳聚糖与亚单位流感病毒疫苗合用,发现壳聚糖可以明显提高其局部和血清抗体反应。Seferian[14]等将壳聚糖与β2人绒促性素联合接种于Balb/c小鼠,使其产生的抗体滴度维持在高水平的时间延长,引起了明显的免疫反应。
5 发展趋势和展望

随着DNA重组疫苗、合成肽疫苗等新型疫苗的不断涌现，免疫佐剂的研究越来越受到人们的关注，人们对佐剂也有了更深一步的认识。开发研制新型的免疫佐剂不仅仅可以增强疫苗的免疫效力、减少疫苗的毒副作用，还可用来治疗某些疾病，这将是佐剂的未来发展趋势。理想佐剂应该具备以下特点：安全无长期的毒副作用,易于生产,能产生较强的免疫反应,易于从体内清除,价格低廉。由于常规佐剂有其自身的缺陷使之很难适应新型疫苗的发展，但随着科技进步，研究不断深入，佐剂存在的诸多问题将逐一被解决，将有更多的佐剂用于人类疫苗免疫接种，佐剂系统的有效应用会在人类疾病预防等领域发挥更大的作用。
[1]   RpbertLHunterOver view vaccine adjuvants present and future[J]. Vacine, 2002, 20: 7- 12
[2]   梁存军，王健，吕凤林，李晓敏，熊仲良，张一. 铝佐剂作用机制及其在人用H5N1灭活疫苗中的辅助作用[J].生物工程学报，2008,24(1):8-14.
[3]   尹荣兰，李昌，张乃生. DNA疫苗免疫佐剂研究进展[J].中国兽医杂志，2008,44(4):77-79.
[4]   蒋鸿超，李鸿钧，孙茂盛. 肿瘤DNA疫苗佐剂研究进展[J].生物技术，2005，15（6）：90-93.
[5]   王妍，曹淑桂. 人用疫苗佐剂的发展和应用[J].中国生物制品学杂志，2005,18（3）：270-272.
[6]   李瑶瑶，明恒强. 我国免疫佐剂的研究现状[J].兽药与饲料添加











剂，2009,14（5）：11-14.
[7]   杨慧敏，肖松云，李文刚. 新型佐剂研究进展[J]. 郑州牧业工程高等专科学校学报，2009,29（3）：13-16.
[8]   李庆军，黄引平. Toll样受体的研究进展[J].新乡医学院学报，2005， 22（2）：167-170.
[9]   黄孝天译，刘晶星审校. 新型佐剂的研制方向[J].国际生物制品学杂志，2006,29（3）：133-135.
[10] Ott G,Radhakrishnan R, Fang JH,et al.The adjuvantMF59:A10 Yearperspective.In:O'Hagan D T. Vaccine Adjuvants,Preparation Methodsand
Research
Protocols.
New
Jersey:
Humana
Press,2000.211-228.
[11]  Ellis RW.Technologies for the design, discovery, formulation and a[12]   窦志芳，冯前进，闫娟丽，耿炤，张亚中，何金洋.壳聚糖免疫调节作用的研究进展[J].中华中医药学刊，2007,25（10）：2075-2076. [13]   Bacon A,Makin J, Sizer PJ, et a.l Carbohydrate biopolymers en-hance antibody responses tomucosally delivered vaccine antigens[J] . Infection and Immunity, 2000, 68(10): 5764-5770
[14]  SeferianPG,MartinezML. Immune stimulating activity of twonew chitosan containing djuvant formulations [ J] . Vaccine,2000, 19 (6): 661-668
d-ministration of vaccines.Vaccine,2001,19:2681-2687.