[转移帖]求终止甲醛灭活的亚硫酸氢钠的浓度

zhaox

原帖由论坛会员caizhuoteng发表于 2012-2-15 04:00 |：

做乙脑的，领导要求做1:2000甲醛灭活的灭活曲线，终止剂应该用多少浓度的亚硫酸氢钠？请诸位不吝指教

zhaox

crazy发表于 2012-2-15 08:48 | ：

这个灭活病毒需要加终止剂么？？？……

乙脑死苗没搞过，但其他很多病毒用甲醛灭活肯定是不加的。

需要加东西进去，不是又添加了东西么？
而且加的东西可是亚硫酸氢钠呀，又是酸性物质，降低pH容易破坏结构，造成蛋白不可逆变性不说了吧。这个东西释放SO2，还有毒性，又是还原剂，还是漂白剂.........

zhaox

caizhuoheng发表于 2012-2-16 02:10 ：

我没说清楚，斑竹误会了，我错。
我是要做甲醛灭活乙脑的灭活曲线，从甲醛加入为0时，测1小时、3小时、6小时等等各个时间点的PFU，画出一条活病毒的数量衰减曲线。所以到时间点了就得朝样品加终止剂终止灭活。
既然斑竹说亚硫酸氢钠不行，那请问我应该用什么做终止剂？

zhaox

carzy发表于 2012-2-16 09:01 | ：

哦，原来你说的灭活曲线是要想测一定浓度的甲醛灭活不同时间，病毒数还剩多少没有被灭活的？
这个虽然想法是有科学根据的，但可操作性上嘛，可能还是有很大难度。
要想加入的东西，即中和甲醛，又不影响病毒，这种物质俺们没想到……不知还有坛子还有哪位大神有这方面的知识。一般生产车间如果用甲醛熏蒸，是用氨水中和残留的甲醛，这个是一个缩合反应，生成的物质叫啥玩意儿我也忘了，但是遇热又会分解成甲醛和氨的，就是分析化学里滴定铵根的那个经典的反应。
另外你说的亚硫酸氢钠和甲醛的反应是个亲核加成反应，要用甲醛往饱和亚硫酸氢钠溶液中加才行。
要不你直接点，不用终止反应，不要追求在同一次测，而分开在不同时间测。试试，不同时间制备6孔板或者12孔板。只要上板子前，保证细胞浓度差不多就行了，都培养相同的时间。用甲醛灭活不同时间后，直接按时间顺序上板子测PFU。你做了不同的稀释度，甲醛也就被稀释了，影响可能会小一点。

不过我觉得甲醛灭活你们要不主要关注究竟有么有完全灭活吧，参考一下其他病毒，比如流感的甲醛灭活时间。

zhaox

caizhuoteng发表于 2012-2-17 04:53

谢Crazy大哥的指导。
情况是这样的，我们一直是用β-丙内酯灭活病毒的，但却发现浓缩后的病毒液里的碳酸氢钠缓冲体系扛不住1:4000的β-丙内酯，水解后pH值下降，可能破坏病毒结构完整性，导致纯化后原液EIA值很高，打小鼠却没有一点效力。后来我们尝试在收获病毒液时朝病毒收获液里加甲醛，预先固定病毒再纯化，发现效果还不错。于是就有想法了，想在纯化第一步就用甲醛灭活和固定病毒，之后再柱层析就除掉甲醛。所以才会要做甲醛的灭活曲线，来验证甲醛的灭活效果，如果可以就取代β-丙内酯。

zhaox

Crazy发表于 2012-2-17 10:32 |

呵呵，倒是不止一个病毒用甲醛灭活后的动物试验效力比BPL好，在你这里又验证了一下。
不过在别的单位我所知灭活乙脑是用BPL灭活的，可能灭活条件有差异吧。
提供一点小参数给你参考，甲醛灭活：   
1:4000灭活7天；1:2000灭活4天，完了做好灭活验证应该可行。
如果实在需要灭活曲线，终止反应我也不知道怎么弄，不行就稀释直接测PFU。

zhaox

pipi302发表于 2012-2-18 11:09 |

以前记得看过篇文献，确实是用亚硫酸氢钠进行中和的，但具体的量不好把握，我去找找那篇文献

zhaox

Caozhuoteng发表于 2012-2-20 00:36 |：

谢谢斑竹，其实我一直也是用BPL灭活的，只是BPL酸性太强了，M199的碳酸氢钠缓冲体系扛不住，水解后酚红明显变黄，所以才想换甲醛。
另外甲醛灭活的温度是4℃吗？