Vero细胞疫苗中宿主细胞蛋白（HCP）检测研究简介（ZT）

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生物制品组　 田博
        Vero细胞HCP是指疫苗中来源于宿主细胞的蛋白成分，其主要成分包括：宿主细胞结构蛋白和转化蛋白（细胞分泌的促生长蛋白），前者的危险性在于引起机体过敏反应，后者的潜在危险性在于引起细胞转化。以Vero细胞为基质细胞生产疫苗的过程是将病毒接种于Vero细胞，病毒利用细胞环境复制自身，同时导致宿主细胞结构受损、死亡，释放大量的宿主细胞结构蛋白于疫苗中，这部分蛋白有可能成为疫苗中的过敏原；Vero细胞生长的同时向培养液中释放生长因子等促生长蛋白，可引起细胞增殖和分化，Vero细胞结构蛋白和促生长蛋白构成宿主细胞蛋白（以下简称HCP）。
        目前，CHO细胞与Vero细胞被WHO和我国药品监督管理局认可，用于生物制品的生产的传代细胞。Vero细胞（一种非洲绿猴肾的传代细胞系）是一种理想的疫苗生产基质：遗传背景清楚，核型稳定，无外源因子污染，160代以内没有致瘤性，适合大规模培养，可用生物反应器生产，保证了疫苗大批量细胞的均质性和安全性。

       Vero细胞已经用于疫苗的生产：80年代法国率先使用Vero细胞生产脊髓灰质炎疫苗和狂犬病疫苗，一亿二千万人份人群接种的结果证明Vero细胞作为疫苗的细胞基质是安全和有效的。1994年维尔博狂犬病疫苗进入我国并投放市场。目前，我国已正式生产Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗。其它正在开发、研究和生产的疫苗有流感疫苗、出血热疫苗、甲肝疫苗、轮状病毒疫苗、SARS疫苗等等。
        WHO推荐使用Vero细胞生产疫苗：WHO于1987和1998年分别组织制定了《使用传代细胞生产生物制品规程》和《使用动物细胞生产生物制品规程》。在前者中提出：使用传代细胞生产生物制品，必须经过纯化，疫苗中残余DNA不得超过10ng/剂量，去除疫苗中毒性蛋白， 但对 HCP残留量没有提出明确要求。但在后者中已对传代细胞的HCP残留量提出了指导性要求，即将传代细胞HCP含量降低至可接受水平。表明WHO 已开始关注HCP的含量及其对于疫苗安全性的影响，需要加强探索性研究。
        疫苗中的HCP可成为疫苗的过敏原：有研究报道提示，通过豚鼠皮肤被动转移试验证明地鼠肾细胞可引起豚鼠过敏反应；浓缩的地鼠肾细胞狂犬病疫苗过敏反应的发生可能与疫苗中地鼠肾细胞成分增多有关。也有研究表明，地鼠肾细胞乙脑疫苗的过敏反应可能与疫苗中地鼠肾细胞蛋白含量高有关。但少见有关HCP检测方法以及在疫苗中基本安全限量方面的研究报道。
        新近，为了弄清Vero细胞HCP是否引起过敏反应及可能的最低剂量，有研究者采用Vero细胞培养的无牛血清、无人白上清制备了二批Vero细胞HCP抗原，一批用于免疫动物制备免疫血清，另一批用作酶标试验的标准品和免疫原性试验的样品。用Vero细胞反复冻融的方法制备了一批Vero细胞裂解蛋白 ，用于豚鼠过敏原性试验的比较。
        结果表明Vero细胞裂解蛋白和Vero细胞HCP均可成为过敏原，引起豚鼠过敏反应；过敏反应的强度和过敏原的剂量呈正相关；当Vero细胞裂解蛋白和Vero细胞HCP降低至50ng/只以下时，没观察到任何过敏反应的症状。因此，提示疫苗中Vero细胞HCP具有过敏原性，其含量应限定小于50ng/ml。
        为了定性分析Vero细胞疫苗生产过程中HCP含量的变化，采用SDS-PAGE和Western Blot法分析了Vero细胞疫苗生产过程中HCP含量的变化，结果表明目前一些纯化苗中含有一定量的HCP。因此，应对成品苗中的Vero细胞HCP进行限量。
         通过对包被液、封闭液、抗体工作浓度及相应的的工作条件的优化，建立了间接ELISA法相对定量检测Vero细胞 HCP的方法，检测的线性范围为31.25ng/ml~500ng/ml。 利用所建立的ELISA方法，对Vero细胞乙脑疫苗生产过程的中间产品进行了Vero细胞HCP的测定, 生产过程中Vero细胞HCP的总去除率达到99%以上, 由此推算成品苗中HCP的含量可降低到9.125-7.5ng/剂。
　    上述初步研究结果表明：疫苗中Vero细胞HCP的含量多少可能与豚鼠过敏反应的发生具有正相关性，因此疫苗生产企业在研制Vero细胞疫苗时应对疫苗中Vero细胞HCP残余量给予关注，结合有关安全性试验，研究并制定合理的HCP的内部质控标准，将有利于企业提高产品质量，减少疫苗副反应的发生率；可以通过酶联等方法，尝试建立相对定量检测Vero细胞HCP含量的质控方法。

细胞基质的质量控制
        大多数现行疫苗是通过组织培养的方法制备的，所谓组织培养是体外培养一定量的动物细胞并接种病毒，利用病毒在细胞内增殖，得到预期的病毒抗原，然后制成疫苗。
        众所周知，疫苗的质量控制是全面的质量控制，包括原材料、生产过程、半成品、成品，细胞基质是疫苗生产的主要原材料，其质量控制直接影响终产品的安全性。本文简要介绍WHO对细胞基质质量控制的要求。
一、细胞基质的种类
1.  原代细胞：动物组织经胰酶消化培养成单层细胞，用于病毒的培养。如地鼠肾细胞、沙鼠肾细胞、猴肾细胞、兔肾细胞、鸡胚细胞等。在疫苗的生产中使用了40多年，证明是安全有效的。
优点：1）相对简单；2）具有广泛的敏感性。
缺点：1）有较严重的潜在的病毒污染问题，动物的级别很难达到SPF级；2）来自不同动物的质量和敏感性有差异；3）动物来源越来越困难，尤其是灵长目动物。
2.  二倍体细胞：具有一定的传代寿命，超过一定代次，细胞衰老。如2BS细胞、MRC-5细胞等。在疫苗的生产中使用了30多年，证明是安全有效的。
优点：1）能够充分鉴定和标准化；2）使用种子库系统生产。
缺点：1）不易大规模生产，尤其是不能微载体生物反应器。2）对培养基及牛血清的要求较高。
3.  传代细胞：理论上具有无限传代的寿命。如Vero细胞、BHK21细胞等。
优点：1）能够充分鉴定和标准化；2）使用种子库系统生产。
3）可大规模生产，可用于微载体生物反应器。4）对培养基及牛血清的要求不高。
缺点：理论上有致肿瘤性的危险。但已证明Vero细胞在134~150范围内使用，无致肿瘤性。
二、动物细胞的潜在危险
1.  病毒污染：
1）人类或灵长目动物细胞可能携带潜在病毒，如乙型肝炎病毒、逆转录病毒等。
2）禽类组织细胞隐藏着外源和内源性逆转录病毒，
3）啮齿类细胞隐藏着外源和内源性逆转录病毒，
2.  细胞DNA
l  原代细胞和二倍体细胞的残余DNA无危险性。
l  传代细胞系的DNA具有是其他细胞生长失控和产生致肿瘤活性的潜在能力。并认为<10ng/剂量是安全的。
3.  促生长蛋白
        生长细胞可分泌生长因子，认为不构成严重危险。但使用传代细胞生产的疫苗，应进行纯化，去除细胞蛋白。
三、WHO的有关要求
（一）对所有生产细胞的要求
1.  GMP
1）规范的操作；
2）原材料的选择，细胞的供体应无传染病或病因不能确定的疾病。
2.  细胞培养中的有关检测
1）牛血清：无细菌、真菌、支原体和感染性病毒。有些国家还要进行无噬菌体的检测；有些国家使用辐射的方法灭活潜在污染的病毒。用TSE非疫区的牛血清。
2）胰酶：无细菌、真菌、支原体和感染性病毒，特别进行牛或猪细小病毒的检测；有些国家使用辐射的方法灭活潜在污染的病毒。
3）生产结束时的检测：无细菌、真菌、支原体。
4）生产结束时检测外源性病毒。
（1）25%的对照细胞（不接种病毒）无病变；（2）豚鼠红细胞血吸附法检测阴性；（3）转种人二倍体细胞、本细胞系的其他批次、其他种属的细胞系无病变并血吸附阴性。
（二）对传代细胞的要求
1.  建立主代细胞库、工作细胞库
        对于主代细胞库须进行一次全面的外源因子检定，检测可能存在的内源性和外源性外源因子，特别注意已知以潜伏状态存在于来源物种中的因子。主代种子库检定合格后，工作种子库和生产细胞只进行一般的外源因子检查。
l  无菌试验（细菌、霉菌、支原体）
l  细胞法检测病毒外源因子：至少用107细胞转种人二倍体细胞、本细胞系的其他批次、其他种属的细胞系，无病变并血吸附阴性。
l  用动物和鸡蛋检测病毒因子：
1）乳鼠2窝（每窝至少10只），脑内、腹腔注射。
2）成鼠10只，15~20克，脑内、腹腔注射。
3）豚鼠5只，350~450克，腹腔注射
4）家兔5只，1.5~2.5kg，皮下注射
5）鸡胚10只，9~11日龄，尿腔囊。
6）鸡胚10只，5~6日龄，卵黄囊。
以上每组接种待检细胞数量不少于107个，动物观察至少4周，鸡胚至少观察5天，应健存。
l  逆转录病毒的检测：一般用高敏感性的细胞扩增待检细胞培养物中的逆转录病毒，然后进行检测。
1）感染性检测
2）透射电镜检测
3）逆转录酶分析
l 致肿瘤性检测
动物：1）裸鼠；2）新生小鼠或大鼠经抗胸腺血清处理；3）无胸腺小鼠。
        每天动物皮下注射107细胞，以Hela细胞（106 ）作阳性对照，有结节的观察1~2周，解剖做病理检查。无结节的，一半观察21天，另一半观察12周，解剖做病理检
查，应为阴性。
（三） 二倍体细胞
        除要传代细胞的检测项目外，增加细胞染色体分析。
        检测200个分裂中期的细胞，计算染色体数目，检测超二倍体、亚二倍体、多倍体、断裂和结构异常的比例。
四、小结
        细胞基质在疫苗生产中必不可少，其质量的优劣可直接影响疫苗的质量。细胞基质无外源因子污染，是保证疫苗具有安全性的重要因素之一。对于已使用多年并被实践证明是安全的细胞系，可通过细胞种子库及检定进行质量控制；对于一个新的细胞系，应进行全面的系统的鉴定和检定，确保其不含有内源性和外源性的污染 。