免疫胶体金技术影响因素分析

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自20世纪70年代,Faulk等(1971)用胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。免疫胶体金技术的反应过程是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响和制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。

1 耗材的选择

1.1 不同型号膜的筛选硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物和表面活性剂的来源、类型和数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响—膜的孔径和分布结构不同。膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就是假阳性越高。用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小和分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标记物在膜上的流动速率为最佳。

1.2 结合垫的选择结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物和待检测样品,而不被吸附;玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。

1.3 样品垫及吸水纸的选择样品垫和吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫和吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸和样品垫。吸水纸则要有很好的蓄水能力,保证样品中所用的液体都经过膜的反应区而被样品垫吸收和蓄积。

2 关于胶体金的制备

制备颗粒均匀、分散度好的胶体金在金标免疫快速试验中非常关键,如果金颗粒直径的变异范围太大就会影响到试验的稳定性和重复性,如果金颗粒的形状不规则或粒径不均一,使得胶体金标记物容易解离和沉淀而产生金标扩散不完全、反应区底色过深和假阳性现象;而且胶体金质量不好,胶体金结合物就不能快速而完整的从玻璃纤维上解离,从而影响试验结果。

胶体金的制备除了保证药品的质量外,制备过程中的细节关乎胶体金制备的成败。首先是操作环境和所用容器的清洁度。所有进入溶胶内的污物都会干扰胶体金颗粒的生成或使生成的胶体金出现聚堆现象,容器最好经酸洗和硅化处理。操作环境应保持清洁无尘粒,最好有专用工作区。其次,配制溶液均需使用双蒸水或三蒸去离子水配制,烧制胶体金最好用去离子水。再者是不同的还原剂对胶体金质量的影响。胶体金制备基于还原法,改变还原剂的性质和浓度,可制备粒径不同的胶体金悬液。根据试验目的选择胶体金的粒径,根据选择的粒径确定还原剂,如制备金颗粒直径在5～12nm的胶体金溶液用白磷或抗坏血酸还原氯金酸;如制备大于12nm直径的金颗粒的胶体金则用柠檬酸三钠还原氯金酸。此外不同的烧制方法、胶体金的制备量、还原剂的加入方式、加热容器的大小及加热的时间等也影响胶体金颗粒的大小和均一性。根据所需胶体金的粒径和数量,结合自身试验条件选择合适的胶体金制备方法。

3 标记蛋白与相关抗原、抗体的制备

标记蛋白、T线和C线的抗原或者抗体的纯度和浓度直接影响金标探针的质量。获得纯度高、浓度适中的抗原、抗体,关键在于制备和纯化方法的选择及条件的优化。试验前须采用高速离心去杂质,应用饱和硫酸铵沉淀、亲和层析、透析除盐等一系列处理方法,尽可能去除单克隆抗体、二抗和相关蛋白溶液中的高浓度的杂质和多余离子,避免其干扰目的蛋白与胶体金的吸附结合,或导致胶体金粒子的凝聚;特别是硼酸盐和磷酸盐不利于胶体金和蛋白的结合,应尽量避免接触。同时,充分处理各种大分子蛋白,使其尽量分散为单体和具有适当的分子质量,提高胶体金与蛋白质的结合比,便于与胶体金充分而稳定的结合。

4 胶体金的标记

胶体金标记的两个关键环节是标记时的pH和最佳蛋白质标记量的确定。根据胶体金标记的原理,只有在pH接近和稍高于蛋白质的等电点时,胶体金蛋白质的吸附力最强;pH过高过低都不利于两者的结合,因此标记时选择精密的酸碱度测定仪器或者试纸条,采用不同方法重复校正,并进行梯度试验找到最佳的标记pH。溶胶与被标蛋白质的用量比例是否合适是影响标记成功的一个重要因素。过多蛋白质标记,造成浪费的同时引起试纸的拖带现象;过少蛋白质标记,导致胶体金标记不完全,从而降低试纸的灵敏度及假阳性现象的出现。也需要在试验中进行梯度试验,反复比较不同标记量的标记物在破坏试验中的稳定性,确定最佳的标记量。

5 膜包被条件的优化处理

膜的包被条件,包括膜的封闭、环境的湿度、T线和C线上抗原或抗体的浓度、点膜条件、温度、包被时间等,需要结合试验实际情况进行反复调整。包被过程中需要特别注意以下两点:①膜上T线和C线抗原或抗体的包被量要相对饱和;②包被后的膜一定要在适宜的温度下彻底干燥,否则会造成拖带、显色不清晰,灵敏度也大受影响。

5.1 封闭对使用的膜进行处理,特别是进行封闭是一个十分有争议的问题,理论上来说购买回的膜基本上都是已经优化处理好的,直接点膜就可使用。如果点膜前将膜浸泡在封闭液内进行封闭处理,必然扰乱了膜内正常的物质分布,由此引发了许多不必要的麻烦。但是如果在实际的试验操作过程中,发现没有进行封闭的膜出现非特异性条带或者出现拖带现象,或遇到膜不封闭就无法将蛋白质或抗体包被在膜上的问题,就应考虑封闭问题。建议在制作试纸条过程中根据各自标记物的性质及其在膜上的显色情况来选择封闭与否,如果标记效果比较好且在膜上显色清晰而无拖带及假阳性现象出现,则完全没有必要进行膜的封闭。反之,可进行膜的封闭,查找不理想现象出现的原因。用来对膜进行封闭的物质很多,多选用大分子蛋白质如牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEGMW20000)等。常用的封闭方法有流动封闭和膜上定点封闭,前者将封闭物处理在样品垫上,后者将作用物质配成溶液喷涂在膜的特定位置上。

5.2 环境湿度环境湿度对点膜过程非常重要。最佳湿度一般在45%～65%。湿度过低,膜上容易聚集静电荷,点膜容易出现散点,导致测试时出现疏水斑;湿度过高,膜上毛细作用加强,点膜容易引起T线、C线变宽甚至扩散。为了保证点样时膜湿度的均一性,一般在点样前把膜放到该湿度条件下平衡一段时间。

5.3 T线和C线上抗原或抗体的浓度T线和C线上抗原或抗体的包被浓度直接影响其与金标记物的结合比例,最终影响试纸条条带的显色效果。包被浓度过低,膜上的条带显色不清晰或出现条带中空现象;包被浓度过高,会导致C线不显色或者出现拖带现象。若要获得反应稳定、显色清晰的试纸条,须对2条线上抗原或抗体的配合浓度及两者与金标记物的结合比进行调整和比对,以期得到最佳的组合。

5.4 点样位置不同的T线、C线点样位置将带来不同的灵敏度,点样位置上移,金标复合物通过T线位置时速度变慢,反应时间增加,灵敏度升高;反之灵敏度降低。可采用这个方法来改变灵敏度和消除假阳性。

5.5 点样仪器目前有2种点样方式,划膜式和非接触点膜式。非接触点膜式优于划膜式,划膜式需用软管将抗体划到膜表面,而膜本身的物理性质较为软脆,划管会在其表面留下印痕。划痕容易对层析的金标复合物形成阻力,导致假阳性,同时容易出现跑板时在T线位置出现若有若无一条细线,影响结果的判定。点样仪器不仅可以控制T线、C线点样位置,也可通过点膜仪器各种参数的调整控制T线与C线宽度及喷膜速度等细节,达到最好显色效果。需要在试验过程反复调整各项参数做比对试验,观察试纸条的显色情况来决定。

6 缓冲液

缓冲液构成胶体金免疫层析技术的液相载体,在不影响胶体金与蛋白质、抗原与抗体、硝酸纤维素膜与T线及C线蛋白结合的前提下,并为它们的结合反应提供最佳的酸碱环境。缓冲液并不是通用的,不同的反应体系需要不同的缓冲液来支持,这就需要试验者结合自己的试验尝试不同的缓冲液,确定适合自己的缓冲液配方。常用的缓冲体系是在选用的缓冲液(磷酸盐、硼酸盐等)中添加相应的作用物质配制而成,所谓作用物质是解决反应体系出现的某一特定问题而添加的相应物质。比如通过在缓冲液中添加适量的表面活性剂,可起到增加亲水力、增色和避免线条中空现象;也可同时添加几种物质,通过它们之间的相互协同作用共同解决相关的问题,如少量NaCl,减少信号强度,消除假阳性;糖和聚乙二醇作为保护剂,能减缓老化速度,也可以增加亲水力,但也要注意作用物质的添加宜简不宜繁。试纸条制备过程中的很多处理液都是在选择的缓冲液的基础上添加相应的作用物质配置而成的(如封闭液、结合垫处理液等)。

7 样品的处理与结果的判定

7.1 样品的处理方法和加样量临床送检标本(如全血、血清、血浆),不同的单位和检测人员采用的处理方法不统一,也会对结果判定造成影响。如血浆内大量的纤维蛋白原,影响到层析的速度及均一性,直接影响到抗原抗体结合,处理不当甚至出现一种非特异性结合。检测时样品的添加量要相对充足,使膜上的反应充分进行,以便得到清晰的结果。加样量过低,会导致样品在试纸条上层析不充分而出现假阴性。

7.2 结果的判定由于使用胶体金产品的工作人员分布在不同的层次、不同的部门,判定结果时有很大的随意性,判定时间不统一,特别是在工作环境、温度、湿度的影响下,根据标志线的显色时间随意判定结果,而忽略了厂家制定的有效时间。因此在检测时要求工作人员能及时分辨出试验结果出现的假阳性、假阴性现象及异常条带,能在查找原因后复检或结合相关的检测方法重新检测进行比对和确认,避免漏检和错检。

8 产品的保存和验证

8.1 产品的储存刚生产出的试纸条或检测卡一般含有5%～10%的水分,储存过程中环境过干过湿都不利于产品的储存。环境过干膜上的水分蒸发,会使膜变得疏水、带电荷并变脆;环境过湿影响金标记物的质量及T线、C线的显色效果;因此成品的试纸条和检测卡应进行防潮设计,存放时间过长时一般要求避光、密封保存。环境的温度也影响标记物、抗原、抗体的生物活性,在低温条件下可有效延长产品的储存时间。

8.2 成品验证试验验证试验包括特异性试验、线性灵敏度试验、稳定性试验、样品检测、干扰试验、批间批内重复性试验等10个试验,综合评定产品的质量。成品验证试验需要的时间比较长,特别是产品的稳定性试验需要在很长的时间内定期抽样检测。应结合自己的试验,参照相应的国家或行业标准,制定针对性的试验检测成品的特异性、稳定性、重复性及灵敏度等指标,为进一步的优化和最终制成优质的检测试纸条或检测卡提供数据支持。

综上所述,胶体金免疫层析技术的各个环节受到种种因素的影响,也使得以免疫胶体金技术建立的检测方法在实际应用过程中也存在着一些问题,如胶体溶液的稳定性较差、存放时间相对较短及灵敏度受到多种因素的影响而下降等,导致免疫胶体金技术的应用受到一定限制。随着科技的进步,这些问题将在今后的研究中被逐步改善,免疫胶体金技术也将更进一步显示其巨大的优越性,实现半定量或定量检测及多元化检测,拓宽其在光镜、电镜、流式细胞仪、免疫印迹技术、生物芯片等领域内中的应用。

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