呼吸道合胞病毒增毒标准操作规程

天使和海豚

一、实验技术名称：呼吸道合胞病毒增毒标准操作规程
二、实验目的：呼吸道合胞病毒培养，为后续药效学实验服务。
三、药品和试剂   
PS，沈阳六药（批号：0109333）；谷胺酰胺，上海康达（批号：20011012）；5.6％碳酸氢钠，开原化学试剂厂（批号：980402）；MEM，Gibico公司（批号：1090260）；小牛血清，Gibico公司（批号：20000122）
四、仪器设备与材料
倒置荧光显微镜，德国莱卡（型号：LEIT20MIL）；双人超净工作台，沈阳环中（型号：LJH-4）；电热恒温培养箱，上海跃进（型号：H.H.B11.420）；台式压力蒸汽灭菌器，沈阳盛达（型号：DYMⅡ-JBQOL）；超低温冰箱，日本SANYO（型号：MDF382E）；冰箱，沈阳电冰箱厂（型号：BCD-215）；离心机，上海手术器械厂；CO2孵箱，NUAIRE公司等。
Hepa-2细胞珠（在细胞长成单层的70%）；50ml细胞培养瓶，BD Falcom公司（批号：7078262）；10ml无菌移液管，costar公司（批号：4488）；离心管，NUNC公司；无菌吸管，NUNC公司（批号：091145）；方盘，酒精灯，污物瓶等。
五、实验对象
呼吸道合胞病毒Long株，中国预防医学科学院病毒所毒种室。
六、实验环境
实验室环境清洁，温度：22±2℃；湿度：50-60％。
七、操作步骤
1.Hepa-2细胞传代培养：方法详见：“Hepa-2细胞培养SOP”。
2.采用半对数生长期细胞，细胞长成单层的70%以上时，并观察细胞形态良好时，选取备用。Hepa-2细胞以1*105个/ml的浓度接种于50ml的细胞培养瓶中，每瓶5-8ml。
3. 将冻存的病毒株复苏后接种于半对数生长期Hepa-2 细胞上。35℃温箱中，吸附0.5小时，加适量含2%小牛血清的DMEM，继续培养。
4. 于2～5 d 出现细胞病变，每天进行细胞换液（含2%小牛血清的DMEM）。并实时观察CPE情况，待病变达75 %以上时收获病毒。
5.置零下80℃冰箱中2h，37℃反复冻融3次。1500 r/ min离心10min，弃沉淀，收集病毒上清，即为备用的病毒原液，分装后于-80℃保存。
八、实验结果及评价方法
CMIAS医学图像分析管理系统采集图象，观察2-5日，RSV呈细胞融合性病变，圆状。培养1周末，未出现病变者进行盲传七天，未出现病变者位阴性。
九、注意事项
1.每天注意观察细胞病变形态。定时更换细胞生长液。
2.进行RSV病毒培养时，待Hepa-2细胞密集时再进行接种，实验效果好。