慢性乙型肝炎的抗病毒药物研发进展

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乙型病毒性肝炎是指由B型肝炎病毒（HBV）感染而引起的，肝细胞坏死和炎症，可分为急性肝炎和慢性炎，能引起一系列的并发症，如肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌（HCC）。其中，慢性乙型肝炎（CHB）是指能够检测出至少连续6个月的乙肝表面抗原（HBsAg）或（和）HBV DNA阳性。这是一个非常严重的世界性的公共问题。全球曾感染HBV约20亿人，其中CHB感染者为3.5亿人，每年约有78.6万人死于HBV感染所致的并发症。世界卫生组织对肝癌统计显示中国的新发病例数和死亡病例数均占全球的50%以上，且不断上升。全球肝硬化和HCC患者中，由HBV感染引起的比例分别为30%和45%。我国肝硬化和HCC患者中，由HBV感染引起的比例分别高达60%和80%。20多年的乙型肝炎疫苗政策的实施和近些年抗病毒治疗的广泛应用，使得我国婴幼儿HBV的感染率大幅下降，急性HBV发生明显减少，但感染HBV人口逐渐老龄化，近年HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者的所占比例也不断上升。本文对近些年慢性乙型肝炎治疗的靶点和药物做一综述。



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乙型肝炎病毒的复制周期和抗病毒靶点


      HBV生命周期开始于吸附到肝细胞上，即病毒膜表面抗原大蛋白（LHBsAg）与肝细胞膜上的钠离子-牛磺胆酸协同转运蛋白结合(NTPC)结合，然后通过受体介导的内吞作用进入到肝细胞质。经内化释放出病毒核衣壳蛋白(CP)包裹的松弛状DNA，CP经机制不详的磷酸化后在肝细胞核孔入口处脱去衣壳，使裸露的rcDNA进入肝细胞核。之后的rcDNA发生了在宿主DNA聚合酶帮助下的正链缺口修复和在拓扑异构酶作用下的两条环状DNA链的共价连接,最终形成具有超螺旋结构的共价闭合环状DNA（cccDNA）。通常cccDNA主要是以游离基因的形式存在于肝细胞中，作为后续病毒RNA转录的模板。另外cccDNA可以沉默，也可以整合到宿主的基金组里且高度稳定存在于干细胞的生命周期中。尽管肝细胞内cccDNA水平能够通过抗病毒治疗来抑制，但是cccDNA似乎很难被根除。cccDNA可以编码4种主要的RNA转录体，其中最大的RNA转录体具有信使RNA（mRNA）和前基因组RNA（pgRNA）的功能。pgRNA作为逆转录、聚合酶翻译和核衣壳蛋白合成的模板。病毒蛋白的翻译涉及到4种重叠的开放阅读框（ORF）：表面包膜（S）、核衣壳（C），聚合酶（P）和X。S的ORFs编码3种不同表面膜蛋白：大、中、小的HBsAg蛋白，C的ORFs编码病毒核心抗原（HBcAg）和前核蛋白。HBcAg介导pgRNA的衣壳化。前核蛋白最终在内质网中经过蛋白水解变成病毒e抗原（HBeAg）。HBeAg可能有免疫调节作用，能够促进宿主内的慢性感染，是病毒复制的重要标志。P的ORFs编码HBV聚合酶，该聚合酶在复制过程中有多种功能，包括促进病毒DNA的合成，逆转录和pgRNA的降解。X的ORFs编码病毒X蛋白（HBxAg），被认为涉及多个功能如细胞周期调控，信号传导，转录激活和病毒DNA修复，还与肝癌的发生相关。HBV核衣壳的装配是在肝细胞质里开始的'。PgRNA封装在核衣壳里成为逆转录和新的HBVDNA合成的模板。PgRNA在HBV DNA聚合酶的介导下发生逆转录生成新病毒粒子，即衣壳化的rcDNA。病毒rcDNA接下来既可以重新脱衣壳进入肝细胞核形成新的循环，增加肝细胞核内的病毒cccDNA存储，也可以同富集在内质网上的HBsAg蛋白发生进一步的装配，形成成熟的子代HBV，最终通过发芽或膜泡运输分泌到宿主细胞外。
      通过上述乙肝病毒生命周期的介绍，知道如果能切断生命周期中的某一个环节，就可以破换病毒的复制甚至杀死病毒细胞。如此本文以病毒的生命周期的不同阶段及发生过程来总结潜在的靶点，如表1所示。




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已上市的抗慢性乙型肝炎病毒


      自1992年美国FDA批准a-2b干扰素治疗慢性乙型肝炎以来，相继又有6种药物获批，如图一所示，分为两类，即2种干扰素和5种核苷酸药物。其中干扰素类因其有固定疗程，不易产生病毒耐药性，HBeAg和HBsAg血清转化率高而且应答持久，具有调节免疫和诱导细胞合成多种抗病毒蛋白的双重功效被美国FDA最先批准用来治疗乙肝。长效干扰素IFN-α（a-2a）较普通干扰素（a-2b）能取得更高的HBeAg血清转化率、HBV DNA转阴率，ALT复常率等。但因为干扰素类药物不良反应多，还有禁忌人群范围比较广，经济负担大，所以限制了它的广泛使用。而核苷类药物因其有效性、易行性、安全性的优点被大家广为认可，也是近年来抗病毒药物应用和研究的热点。

      虽然核苷酸药物的作用机理都是抑制乙肝病毒DNA合成，从而发挥抗乙肝病毒的疗效，但因化学结构不同，影响病毒DNA复制的不同环节而在疗效和耐药上有所区别，具体如表二分析。这五种药物都是前药，首先需要在细胞内活化，生成活性磷酸盐代谢产物，通过竞争抑制内源性核苷酸参与到HBV-DNA的复制，都作为HBV病毒聚合酶的抑制剂，阻断cccDNA的扩增，但不能完全根除cccDNA。通过表二中疗效（HBV DNA转阴率）和耐药发生率及药物经济性的比较发现恩替卡韦和替诺福韦酯都有着强效、高基因屏障、高病毒学应答率的突出优势，故2015年中国的《慢性乙型肝炎防治指南》和亚太肝脏研究协会的《慢性乙型肝炎防治护理指南》以及世界卫生组织的《慢性乙型肝炎防治护理指南》都把恩替卡韦和替诺福酯作为初治患者优选的抗慢性乙型肝炎病毒的药物。同时也可联用无交叉耐药位点的药物，但需谨慎。临床上应坚持个体化、规范化用药原则，才能最终获得最大收益。




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抗慢性乙型炎病毒的在研药物概述


      众所周知，目前治疗HBV的临床药物主要有 两类:干扰素和核苷酸类似物,前者不良反应较大,后者存在病毒耐药问题,且都不能根除细胞核中的cccDNA。因此，针对HBV不同靶位的新药研发显得意义重大。从HBV生活周期的分子生物学特点和抗病毒治疗的研发过程来看,要根除HBV感染,从多个角度切入都有发展前景(表3,来源于乙型肝炎基金会,截止到2016年1月)可以归成三大类。

      第一大类是以病毒DNA聚合酶为靶点,目前的3个小分子都属于A型无环核苷类似 物。以富马酸替诺福韦艾拉酚胺（TAF）为例,其血浆稳定性比TDF更好,进入乙肝感染的细胞后仍能保持最大程度的完整性。已证明该药在低于TDF的1/10剂量时即25mg，就具有非常高的抗病毒效果，同时可改善肾功能和骨骼安全方面的参数。第二大类是以病毒复制过程中的相关蛋白为 靶点，依据病毒的生命周期，首先是RNA干扰基因沉默的小分子包括ARC-520，ISIS-HBCRX等，它们通过RNA分子抑制基因表达和新病毒体释放。其中ARC-520最具典型代表，因为它已经处于临床II/III期，具有功能性治疗乙肝的潜力。其 次是核衣组装效应分子包括NVR3-778等,它们通过引起病毒粒子的不稳定来抑制HBV复制,前期研究显示这些小分子的安全性和耐受性良好,具有治愈性的潜力。再者是病毒入侵和释放抑制剂，包括抑制吸附NTCP的小分子CPI-431-32，Myrcludex B等以及抑制HBsAg释放的Rep2139-Ca等。前期基础研究表明具有很强的表面抗原抑制性。第三大类是以免疫细胞为靶点，可分为治疗性疫苗和toll样受体激动剂两种。其中治疗性疫苗的I期临床显示均有良好免疫应答,但GS-4774的临床II期治疗效果并不理想,乙肝表面抗原的血清未达到治疗水平。Toll样受体主要存在于免疫细胞上，提前触发开启机体的免疫应答，杀灭入侵的病毒。目前这类激动剂中最早开发的GS-9620也还处于临床疗效评估中。



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小结与展望


      综上所述，尽管目前还没有完全治愈的药物，但我们的应对策略是明确的，就是继续应用乙肝疫苗保护易感人群。临床上提倡使用强效、高基因屏障的药物来治疗该疾病，且坚持个体化、规范化用药原则，才能最终获得最大收益。同通过HBV生活周期的分子生物学的基础研究和抗HBV治疗的临床药物研发,我们有信心找到的靶点和新型治疗药物,最终实现慢性乙肝的根治愿望。
      来源：毛水燕；沈阳药科大学工商管理学院；Chinese Journal of new Drugs 2016，25（17）