Nature子刊：在标准实时PCR仪中超快地开展无校准测定

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分子诊断在检测遗传疾病、监控抗癌疗法疗效和抵抗侵袭性细菌感染中发挥着越来越重要的作用。隶属于Scope Fluidics集团（Scope Fluidics group）的Curiosity Diagnostics公司（以下称作CD公司）开发出一种新的DNA分析技术：协同PCR（synergistic PCR, sPCR）。这种方法将如今的两种最为流行的遗传密码分析技术的优势结合在一起，能够在广泛使用的仪器上执行。相关研究结果于2017年3月22日在线发表在Scientific Reports期刊上，论文标题为“Calibration-free assays on standard real-time PCR devices”。

波兰科学院物理化学研究所（IPC-PAS）教授Piotr Garstecki（也在CD公司任职）说，“我们提出的这种DNA检测技术是开发创新性的PCR|ONE分析仪期间想出的。利用这种分析仪仅在7分钟内就可完成对遗传密码的测试。它比常规测试方法所需的时间缩短了7倍多。”

用于DNA测定的样品通常含有如此少的遗传物质以至于利用常规的实验室技术对它们进行分析是不可能的。在消除样品中的杂质之后，第一步就是增加遗传物质数量，经常增加高达10亿倍。聚合酶链式反应（PCR）就是为完成此目标。

PCR扩增反应涉及对含有被扩增的遗传物质和合适的试剂的溶液进行循环加热和冷却。这些试剂包括一种催化DNA合成反应的聚合酶；合成DNA链所需的核苷酸；引物，即能够结合到被扩增的遗传密码片段（如特定的基因）的起始处和结束处的短DNA片段。每个PCR循环分为加热阶段和冷却阶段。在加热阶段，在大约95℃的温度下，DNA的氢键被破坏，因此DNA双链分裂成两个单链。在冷却阶段，在大约50℃的温度下，溶液中的引物结合到这些DNA单链的对应位点上，此后，这种聚合酶合成出位于这些位点之间的互补链。在理想条件下，在每个循环结束时，双链DNA片段的数量是每个循环开始时的2倍。

PCR被用来检测遗传物质的特定片段和估计遗传物质的初始数量。定量测定通常是利用一种被称作实时荧光PCR的模拟技术开展的。在对样品进行扩增时，在随后的扩增循环中，利用荧光染料检测样品中的DNA数量。当荧光变化的强度超过一种设定的阈值时，遗传物质的初始数量可基于循环数加以估计。这种模拟PCR技术是相对简单的，但是由于PCR灵敏度，甚至颗粒杂质的存在，它需要仔细地和持续地校准。

另一种方法是数字PCR。样品被等体积地分成几万或几十万份，有时甚至是几百万份。随后，在每份样品中，对遗传物质进行扩增，而且如果设定的变化出现的话，那么就测定它的数量。在对样品DNA进行分配期间，DNA分子仅适合进行一些分配，因此设定的变化不会都会出现。因此，样品中的DNA初始数量能够基于记录的信号数量加以估计。数字技术的优势在于没有必要对数字PCR仪进行校准。然而，鉴于需要平行开展大量的反应，这种测试仪器是昂贵的，在实验室中并不像模拟PCR仪那样比较常见。

CD公司和IPC-PAS提出的sPCR技术将这种模拟PCR和数字PCR方法最为重要的优势结合在一起。为了获得可靠的测量，对样品仅稀释十二份，或者最多几十份。这种方法不需要校准。

在CD公司开发了这种sPCR方法的IPC-PAS博士生Pawel Debski说，“我们的技术的特征是较少的稀释份数，这具有十分重要的现实意义。”

由于少量的样品稀释份数，这种sPCR技术要比数字PCR更容易执行，而且略快一些。然而，相比于模拟PCR技术，它需要更多的试剂。根据这些研究人员的说法，它将不会替换模拟PCR技术。不过，它可能是一种有价值的新技术，这是因为它不需校准，因而允许实验室工作人员独立地验证模拟PCR测量的准确性。

Garstecki强调道，“我们的DNA测试技术已被申请专利。不过，我们想要突出可自由地将它用于非商业目的。鉴于它利用常规的流行的基因测试仪器，所有你需要开始做的是获得我们的文章。”

在标准的PCR仪中，样品与附近的大块交替加热或冷却材料之间相对较慢的热量扩散被用来加热和冷却遗传物质。在PCR|ONE仪器中，红外线照射被用来快速地加热样品。扩散冷却机制也被加以改进：用于这种目的的冷却材料块被常规的仪器中的更小，而且它被维持在一种恒定的严格受到控制的温度下。由于技术改进和分析方法改进，这种PCR|ONE原型能够在不到15分钟内完成DNA分析，而且这种sPCR方法本身仅需7分钟。首批PCR|ONE仪器最有可能将在两到三年内上市。


Pawel R. Debski, Kamil Gewartowski, Seweryn Bajer et al. Calibration-free assays on standard real-time PCR devices. Scientific Reports,Published online:22 March 2017, doi:10.1038/srep44854