乙型肝炎病毒RNA病毒样颗粒的发现及其对抗病毒治疗临床...

Jianbo

在我国，慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染所致疾病仍是严重威胁国人健康的重大传染性疾病。全国现有慢性HBV感染者约7 000万～9 000万，其中慢性乙型肝炎（慢乙肝）患者约2 000万～3 000万，需立即接受治疗的患者约有700万。然而，目前仅100万～350万慢乙肝患者正在接受抗病毒治疗。虽然积极的抗病毒治疗能够明显延缓肝脏疾病进程、减少终末期肝病的发生，但以血清HBV表面抗原（HBsAg）转阴作为临床治愈的指标，现行的抗病毒治疗药物仅能使很少一部分患者达到功能性临床治愈。对于慢乙肝难以治愈的原因，既往多认为与肝细胞核内HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）过长的半衰期有关，但近年的研究表明，cccDNA的半衰期往往不足2个月。由于现有的抗病毒治疗药物对cccDNA无直接破坏作用，停药后往往发生高比例的病毒学反弹和疾病复发。因此，针对核苷（酸）类药物[NAs）]治疗的患者，各国（地区）的新指南多推荐长期抗病毒治疗。长期甚至终生的服药往往使患者难以接受，影响依从性。

因具有感染性的、完整的HBV病毒颗粒（丹颗粒）所携带的病毒基因组为带有缺口的松弛环状DNA（rcDNA），人们一直认为HBV为嗜肝的DNA病毒。1996年，德国学者Köck等却在慢性HBV感染者血清中发现HBV RNA的存在。我们和其他实验室近期对血清中HBV RNA来源的研究发现，患者血清中的HBV RNA实为未经逆转录的前基因组RNA（pgRNA），这些pgRNA和rcDNA一样，存在于成熟病毒颗粒的核衣壳内，我们称这种病毒颗粒为"HBV RNA病毒样颗粒"。

1．HBV感染复制周期的新认识
HBV RNA病毒样颗粒的发现使我们对HBV的感染复制过程有了更为全面的认知。如图1所示，来自cccDNA的3.5 kb长的pgRNA与具有逆转录活性的病毒DNA聚合酶蛋白（p蛋白）结合形成复合物，招募核衣壳蛋白（病毒核心抗原，core）聚集形成核衣壳。在致密的核衣壳内，多数p蛋白启动逆转录过程，以pgRNA为模板，先后合成出病毒的负链和正链DNA，经多囊泡小体（MVB）释放形成完整的子代病毒。但有一部分并未启动逆转录过程，致使带有pgRNA的核衣壳也获得病毒外膜并以病毒颗粒的形式释放。理论上讲，带有病毒外膜的HBV RNA病毒样颗粒同样具有感染性，可以通过钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白（NTCP）和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）的介导感染肝细胞。其核衣壳进入细胞后，在细胞质环境下可以启动逆转录过程，形成rcDNA并可进入细胞核转化（将rcDNA的正负链修复完整）为cccDNA，建立感染。尽管这一推测尚缺乏实验数据的支持，但考虑到丁型肝炎病毒的病毒结构和感染模式，该推测成立的可能性很大。

注：a：HBV颗粒通过与肝细胞基底细胞膜侧的NTCP受体结合，并在小表面抗原与HSPG结合的辅助下进入细胞；b：宿主细胞的DNA修复系统将rcDNA的正链修复完整，形成cccDNA；c：以cccDNA为模板，转录出长短不一的5种mRNA转录本；d：通过内质网和高尔基体，小表面抗原形成小球形颗粒并释放到细胞外，e抗原释放到细胞外；e：P蛋白与前基因组RNA（pgRNA）结合，招募核心抗原形成核衣壳并将p蛋白与pgRNA包裹；f：在核衣壳内，大部分pgRNA在p蛋白的作用下启动逆转录，形成负链DNA；g：小部分核衣壳内的pgRNA未启动逆转录，直接获得外包膜，以pgRNA病毒样颗粒的形式释放到细胞外；h：P蛋白完成跳转，启动正链的合成；i：一部分核衣壳包裹的rcDNA可通过多囊泡小体，以Dane颗粒的形式释放到细胞外；j：另一部分核衣壳包裹的rcDNA可以直接返回细胞核内补充cccDNA池；k：完成负链DNA合成后，p蛋白未完全完成跳转，在原位启动正链的合成，形成双链线性DNA；l：双链线性DNA易于整合到宿主细胞基因组中，可表达大、中、小表面抗原

图1 乙型肝炎病毒感染复制周期示意图


2．重新定义病毒学应答
对于NAs治疗的慢乙肝患者，现有指南多将血清HBV DNA低于检测下限定义为病毒学应答（VR），并以此作为停药的治疗终点之一。然而，在重新认识HBV的感染复制过程后，我们意识到，血清HBV DNA的消失仅仅代表了病毒的逆转录过程被有效抑制，并不能反映cccDNA的转录活跃状态。这是因为，在阻断逆转录过程后，有转录活性的cccDNA转而以HBV RNA病毒样颗粒的方式产生子代病毒，也就不难理解既往以"血清HBV DNA低于检测值下限"为前提条件的停药有高风险的病毒学反弹和复发了。真正的病毒学应答应该是既无DNA病毒、也无RNA病毒产生的状态。在未来的临床实践中，特别是在接受NAs抗病毒治疗的情况下，我们应该以血清HBV DNA和RNA均低于检测值下限作为病毒学应答的判定标准。


3.HBsAg并不能很好反映肝组织内cccDNA的活性
慢乙肝患者血清中的HBsAg可以小球型颗粒、管状颗粒存在，也可存在于丹颗粒的病毒包膜上，前两种形式的HBsAg数量远远超过丹颗粒。近年的研究表明，HBV通过产生大量的HBsAg来抑制宿主的免疫反应，与维持病毒的持续感染有关。高水平的HBsAg也为诊断HBV感染提供了便利。血清中的HBsAg主要来自感染肝细胞核内的cccDNA。但越来越多的实验结果提示，整合的HBV DNA片段也能转录翻译产生HBsAg。现已知道，在病毒复制的正链DNA合成过程中，当病毒负链合成完毕后，如果作为正链合成起始引物的pgRNA残端未发生适当的跳转而在原位启动正链的合成，就会产生大小约3.2 kb的双链线性DNA（double-stranded linear DNA，DSL-DNA）。DSL-DNA是宿主基因组中病毒DNA整合的主要来源。Mason实验室最近的报道显示，慢性HBV感染者的肝细胞存在大量的HBV DNA整合，最高可有1%肝细胞带有整合的病毒DNA片段，也即患者最多可有上亿的肝细胞带有整合病毒片段。我们和其他实验室的早期研究结果显示，整合的病毒DNA片段的断点多集中在病毒基因组DR1和DR2区域，这样病毒的S基因区域（编码HBsAg）多保持完整，具有转录产生HBsAg的潜能，因此，血清中的HBsAg也可能来源于整合的HBV DNA片段。


4．关于安全停药新概念的建议
cccDNA的清除可能最为接近病毒学治愈。然而，由于cccDNA存在于感染的肝细胞，只能通过肝活组织检查来判断病毒的清除和安全停药，这在临床实践中并不适用。前面提到，以持续的HBV DNA未检出（低于检测下限）为前提的停药有着很大的病毒学反弹和疾病复发风险。故国内外的慢性乙型肝炎防治指南均把血清HBsAg消失甚至抗体转为阳性做为临床治愈的理想治疗终点，以降低停药后发生病毒反弹和疾病复发的风险。然而，接受NAs治疗慢乙肝患者HBsAg消失的比例仍然不尽如人意。延长NAs治疗（2～8年）后，HBeAg阳性和HBeAg阴性的慢乙肝患者HBsAg消失率分别仅为13%和5%），这意味着多数慢乙肝患者将面临着终生用药之虞。

从既往的研究报道和临床实践业已发现，有一定比例的接受NAs治疗慢乙肝患者停药后并没有发生病毒学反弹。对于这些患者，是否有其他的安全停药指标可以将之甄别出呢？前面提到，核衣壳包裹的来自cccDNA的pgRNA仍可以RNA病毒样颗粒的形式释放，其过程不为NAs治疗所阻断。这样，血清HBV RNA的水平就成了反映患者肝细胞内cccDNA存在和转录的最好指标。当血清中检测不到HBV RNA时，提示患者肝细胞内cccDNA的消失或者转录静默，预示着可以安全停药。通过小样本的回顾性临床研究，我们证实，停药点血清HBV RNA未检出的患者发生病毒学反弹的风险明显下降。当然，其临床应用尚需得到大样本的前瞻性研究验证。

5．关于准临床治愈概念的建议
由于HBV cccDNA的半衰期不足2个月。因此，新合成的rcDNA进入细胞核内并转换成cccDNA，对肝细胞内cccDNA池的维持至关重要（图1）。理论上讲，通过长期使用药物可使cccDNA最终被耗竭。然而，临床现实却是，即使是接受长期的NAs治疗的慢乙肝患者，其HBsAg消失的比例仍然很低。对于那些HBsAg持续低水平表达的患者，部分学者一直怀疑其HBsAg是来自整合的HBV DNA片段的持续表达。最近一篇来自香港的报道研究显示，在43例长时间接受NAs治疗（平均治疗时间＞ 7年）的患者，有近半数肝组织内未检测到cccDNA，但却只有1例发生血清HBsAg阴转。进一步分析发现，尽管绝大多数患者其肝组织内HBsAg染色阳性，却有近半数患者肝组织内核心抗原阴性。考虑到核心抗原的mRNA正是pgRNA，这一结果提示患者肝组织cccDNA已发生耗竭或表达静默。该研究还发现，反映肝组织内cccDNA活性的pgRNA与患者血清中的HBsAg没有相关性。考虑到慢乙肝患者肝脏组织高水平的HBV DNA整合，我们有理由相信，这些患者的HBsAg多来自整合的病毒DNA片段。


不同于血清HBsAg，血清中的HBV pgRNA仅能来自cccDNA。前面提到，整合的病毒DNA的主要来源DSL-DNA，全长仅有3.2 kb，无法转录形成3.5 kb长的pgRNA。的确，最近的来自我们实验室和一个德国实验室的报道均显示，血清HBV RNA能够很好地反映肝组织cccDNA的活性。这为通过检测血液中的pgRNA来间接反映患者肝组织内cccDNA的活性提供了可能。我们建议，可以以血清HBV RNA持续检测阴性来反映患者肝组织内cccDNA的消失或者表达静默状态。这些患者尽管cccDNA已被清除或处于持续的表达静默状态，但由于整合的病毒DNA片段可以持续低水平表达HBsAg，他们的血清HBsAg仍可有低值阳性。我们用一个新的"准临床治愈" （para-functional cure）概念来定义这些已经接近临床治愈的患者，以对现有的慢乙肝功能性的"临床治愈" （functional cure）概念进行修订和补充。其意义在于不仅可以让更多的接受NAs治疗的慢乙肝患者安全停药、不再受终生用药之苦；"治愈"率的提高也将使更多的患者愿意接受NAs为主的抗病毒治疗，相信这"准临床治愈"概念必将对未来的临床实践产生一定的影响。

如前所述，血清HBV RNA检测能够准确反映患者肝组织cccDNA活性。为了使更多特定患者发生血清HBsAg转阴或血清学转换、实现临床治愈这一抗病毒治疗的理想终点，建议首先对这些患者进行血清HBsAg和HBV RNA精准定量检测。由于血清HBsAg ＜1 500 IU/ml的慢乙肝患者在接受抗病毒治疗时可产生较好的病毒学应答。若血清HBsAg < 200 IU/ml，病毒学应答率更高。基于此，如果初步将血清HBsAg ＜1 500 IU/ml的NAs经治（在治）慢乙肝患者按血清HBV RNA检测结果分为HBV RNA阳性患者（cccDNA转录及RNA病毒复制）和血清HBV RNA阴性患者（cccDNA耗竭或转录静默）。对前者在继续使用NAs治疗的前提下加用peg-IFN；对后者则停用NAs，改用peg-IFN治疗（图2）。我们相信，这一基于血清HBV RNA检测的以临床治愈（血清HBsAg转阴或血清学转换）为目标的治疗路径（方案）将进一步提高慢乙肝临床治愈率、降低社会成本。


图2 以血清HBsAg和HBV RNA为指标的慢性乙型肝炎优化治疗路径（建议）示意图


总之，在本文中我们完善了病毒学应答的定义，提出了安全停药的标准和准临床治愈的概念。未来应开展前瞻性多中心的研究，以验证以血清HBV DNA和RNA均低于检测值下限作为病毒学应答的判定标准和安全停药指标用于临床实践的可行性。对于血清HBsAg低值阳性的经治和在治患者，未来我们还应探索以临床治愈为目标的、基于血清HBV RNA检测确定治疗方案的治疗路径，通过精准的个体化治疗提高血清HBsAg转阴（或血清学转换）率，让更多人慢乙肝患者实现"临床治愈" 。