乙肝病毒助推预防性肿瘤疫苗曙光初现

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      热休克蛋白gp96（又称GRP94）是位于细胞内质网膜上的热休克蛋白90家族中的一员，在天然免疫和获得性免疫中发挥着重要作用。gp96能作为分子伴侣结合细胞中的肿瘤抗原、病毒抗原或胞内细菌抗原，并将结合的抗原表位呈递给抗原递呈细胞的“专用运输车”MHCI类和II类分子，从而启动特异性T细胞CD8+和CD4+T细胞免疫应答。另一方面，gp96分子本身作为免疫活性分子通过与Toll样受体（TLR）作用，促进CD8+和CD4+T细胞的增殖和分泌细胞因子，促进抗原呈递细胞成熟并增强其功能。中科院微生物研究所的病原微生物研究团队自1997年开展gp96免疫学功能的研究，探索gp96在乙肝感染中介导的T细胞免疫，取得了多项重要进展。2011年在前期研究中发现调节性T细胞（Treg）对gp96免疫活性起负调控作用，课题组进一步查明清除Treg可显著提高gp96的T细胞免疫活性和抗肿瘤活性，为提高gp96疫苗的免疫活性以及目前gp96作为肿瘤自体疫苗在临床中治疗肿瘤提供理论指导；通过乙肝病毒（HBV）转基因鼠模型，发现gp96介导的T细胞免疫应答可有效抑制和清除乙肝病毒，gp96佐剂疫苗能有效激活HBV特异性T细胞，并降低转基因鼠Treg的数量。小鼠免疫5-8周后血清中的HBVS抗原降低50%以上，病毒DNA拷贝数下降1000倍，肝脏细胞中病毒清除95%以上，表明gp96治疗性疫苗免疫能有效打破免疫耐受、激活T细胞清除病毒，这为研发gp96乙肝治疗性疫苗提供依据；同时，首次应用汉逊酵母表达出有免疫活性的重组gp96蛋白，为研究gp96的生物学功能和疫苗佐剂开发奠定了基础。

     2015年初，中国科学院微生物研究所孟颂东课题组研究发现乙肝病毒X蛋白活化肝细胞中NF-κB通路上调热休克蛋白gp96的表达，gp96一方面引起p53泛素化降解抑制细胞凋亡，另一方面转移到细胞膜上作为脚手架蛋白与uPAR、HER2等肿瘤蛋白作用，增强其稳定性或激活下游信号通路，临床样本分析也发现gp96在肝癌细胞膜上高表达与肝癌患者不良预后密切相关。进一步研究发现应用特异抗体或抑制剂靶向细胞膜上的gp96可显著抑制肝癌的生长与转移。该研究揭示胞膜gp96可能可作为新的潜在抗肝癌靶标。（Cancer Letters, 359(2):325-34；Molecular Oncology, doi:10.1016/j.molonc. 2015.03.004；International Journal of Cancer, doi: 10.1002/ijc.29405。）

近日《中国科学报》对孟颂东进行了采访：

长久以来，科学家们一直在尝试使用“癌胚抗原”开发肿瘤治疗疫苗。中科院微生物研究所孟颂东课题组在对来源于胎盘的热休克蛋白gp96的追踪研究中，发现热休克蛋白gp96携带多种胚胎抗原，其中有些抗原与肿瘤抗原具有惊人的相似性。最近，他们又有了新发现。

孟颂东课题组研究发现，热休克蛋白gp96在肝癌细胞膜上高表达与肝癌患者不良预后密切相关。进一步研究发现应用特异抗体或抑制剂靶向细胞膜上的gp96可显著抑制肝癌的生长与转移。该研究揭示胞膜gp96有可能作为新的潜在抗肝癌靶标。

“胞膜gp96作为抗肝癌新靶标有两方面的重要意义。”孟颂东告诉《中国科学报》记者，“一方面gp96只在肝癌等肿瘤细胞表面表达，而正常细胞不表达，说明胞膜上的gp96是肝癌等肿瘤特异性靶标。另一方面，gp96与多个肿瘤蛋白作用、促进肿瘤生长和转移，因此靶向胞膜gp96可望更大限度地抑制和治疗肝癌。”

此前，这个课题组的研究发现，来源于胎盘的热休克蛋白gp96携带多种胚胎抗原，而这些癌胚抗原与肿瘤抗原有着惊人的相似性。实验人员用从小鼠和大鼠胎盘中纯化的gp96—抗原复合物免疫小鼠和大鼠后，可激活肿瘤特异性T细胞和记忆性T细胞，并有效预防乳腺癌、黑色素瘤的发生。而从人胎盘中纯化的gp96同样携带多种T细胞表位抗原，包括HER2和MUC1等典型的肿瘤抗原。

研究表明，HER2、MUC1、uPAR等基因的活化和表达直接促进处于静息期的休眠肿瘤细胞脱离休眠进入活跃的分裂期，从而生长成为致命的肿瘤，“这提示了胎盘gp96可作为新型广谱的肿瘤预防性疫苗”。

“gp96作为分子伴侣蛋白可结合细胞中的抗原肽库，并将结合的抗原通过交叉呈递给MHCI类分子从而直接激活特异性杀伤T细胞，而杀伤性T细胞在控制肿瘤发生中起关键作用。”孟颂东介绍说，“原癌/胚胎基因的重新活化与表达是导致肿瘤细胞癌变的重要原因，通过质谱分析鉴定发现胎盘gp96结合至少几十种原癌基因抗原/胚胎抗原，应用胎盘gp96免疫后可活化多种原癌/胚胎蛋白特异性T细胞，有效监控和清除肿瘤发生早期这些癌变的细胞，从而在最初期抑制肿瘤的发生。”

研究人员同时透露，胎盘gp96结合至少数十种原癌基因和胚胎基因抗原，并可能结合目前未知的有效肿瘤抗原，是理想的多价抗原疫苗，理论上可预防多种肿瘤的发生。

记者同时了解到，来源于患者肿瘤组织的gp96肿瘤自体疫苗在欧美国家已经临床用于多种肿瘤治疗，并未出现严重的毒副反应和自身免疫疾病。

结缘gp96始于2001年，当时孟颂东找到一个肝癌组织中与gp96结合能激活T细胞的抗原。随后，他到美国西南医学中心从事乳腺癌的休眠研究。

孟颂东告诉记者，乳腺癌患者可能在20年前就有癌前病变的细胞，所以提前让癌细胞永远休眠很有意义。那么，怎样让肿瘤细胞休眠呢？

回国后，在国家自然科学基金重点项目和科技部“863”计划项目的支持下，孟颂东带领学生着手这一研究，他们将同源的肿瘤细胞移植进入小鼠体内。结果发现，大部分经过胎盘gp96免疫过的小鼠会迅速诱发特异性T细胞应答，抑制肿瘤生长进而存活，未被免疫过的小鼠则全部死于肿瘤。研究还表明，对比100%诱发乳腺癌的未免疫大鼠，经胎盘gp96注射的大鼠无一患癌症。

“当前用于临床的所谓肿瘤预防性疫苗主要集中在通过疫苗免疫预防引发肿瘤的病原微生物感染从而间接降低特定肿瘤的发生，如人乳头瘤病毒（HPV）疫苗预防宫颈癌，乙肝疫苗预防肝癌等。而真正意义上直接抑制肿瘤发生的预防性疫苗研究和设计长久以来仅仅停留在概念上，其中最主要的原因是很难发现能有效预防肿瘤的免疫活性高且安全可靠的抗原作为设计疫苗的靶点，包括肿瘤特异性抗原和在肿瘤细胞过表达的蛋白。”孟颂东介绍说。

有研究发现使用肿瘤相关抗原（如MUC1和HER2）、组织特异性自身蛋白（如α—乳清蛋白）或肿瘤干细胞作为疫苗，虽然动物试验表明能预防特定的肿瘤发生，但容易产生自身免疫疾病或难以大量制备，距离临床应用尚有很大距离。

“与上述单价疫苗相比，来源于胎盘的gp96结合至少几十种癌胚抗原，具有广谱的抗肿瘤免疫活性；gp96自体免疫治疗肿瘤已经在美国被FDA批准治疗黑色素瘤和肾癌的孤儿药，安全性很高；而且胎盘很容易获得，胎盘gp96在大规模制备技术上也不存在问题。因此，胎盘gp96有望开发成为预防多种肿瘤的疫苗。”孟颂东对他们的成果信心十足。

不过，这种预防性疫苗研究仅是迈出了第一步，距离应用于人类还有很长的一段路要走。“不过一旦成功，著名演员朱莉切掉双乳的悲剧将不再重演。”

而这也是孟颂东和他的学生们所期待的：希望自己研究的疫苗能进入临床试验，最终能够像接种牛痘疫苗预防天花一样预防肿瘤。