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细菌、真菌、放线菌对紫外线的敏感度不一样，应选择合适的波长，如果波长不可调节，尽量摸索合适的照射时间，诱变剂量对筛选有很大的影响。 第十一章 菌种选育与保藏
菌种选育(selection strain)的目的是改良或改变菌种的特性，使其符合工业生产或科研的要求。菌种选育过程由三个环节组成：一是使菌种产生变异；二是筛选出变异的菌株；三是使变异菌株的特性得到表达。根据使菌种产生变异的方式的不同，菌种选育可分为自然选育、诱变育种、杂交育种、基因工程这四种方法。自然选育、诱变育种是利用基因突变来获得优良菌种，具有改良菌种特性的性质。杂交育种、基因工程是通过DNA重组来获得优良菌种，具有改变菌种特性的性质。
菌种选育技术的应用大幅度提高了微生物发酵产量，促进了微生物发酵工业的发展。通过菌种选育，抗生素、氨基酸、维生素、酶制剂等的发酵产量提高了几十倍、几百倍、甚至几千倍。例如青霉素发酵单位从最初的20u/ml提高到60000u/ml。菌种选育在提高产品质量、改变产品组分、改善工艺条件、扩大新的品种、增加菌种遗传标记等方面也发挥了重大作用。例如青霉素的原始生产菌株产生黄色色素，使成品带有黄色，经过菌种选育，产生菌不再分泌黄色色素，提高了产品质量；卡那霉素产生菌经育种选育后，由生产卡那霉素A变成生产卡那霉素B，改变了产品的组分；土霉素产生菌在培养过程之中产生大量泡沫，经诱变处理后改变了遗传特性，发酵泡沫减少，可节省大量消沫油并增加培养液的装量，改善了发酵工艺条件；微生物原来不产生干扰素，经基因工程育种获得的基因工程菌生产干扰素，扩大了微生物发酵生产的产品范围；采用诱变方法获得营养缺陷型和抗药性突变株是常用的菌种遗传标记方法。
菌种选育的理论基础是微生物遗传学和微生物代谢调节控制理论，在菌种选育工作中灵活应用这些理论是成功的关键。本章将介绍菌种选育的基本方法。
一个优良的菌种被选育出来以后，要保持其生产性能稳定、不污染杂菌、不死亡，这是菌种保藏的主要目的。本章将介绍菌种保藏的原理和一些常用的菌种保藏方法。
第一节 自然选育
不经过人工诱变处理，利用菌种的自发突变而进行菌种选育的过程，叫做自然选育或自然分离。自然选育可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产、提高发酵产量的目的。
发酵工业中使用的生产菌种，几乎都是经过人工诱变处理后获得的突变株。因此生产菌株往往具有遗传上不够稳定和生活力弱的特点，在使用过程中容易发生菌种衰退现象。在发酵生产过程中，菌种的自然选育是一项日常工作，通常一年应进行一次自然选育工作。
应该认识到，虽然生产菌种来自一个性状优良的微生物个体，但随着其后的传代培养，使用时的生产菌种是由众多的微生物个体组成，其中有许多已发生了变异的个体，其中使发酵产量降低的负变异的个体数目大大多于使发酵产量提高的正变异的个体。随着传代培养的延续，上述现象将更加严重。这样总的表现是菌种生产性能衰退。下面我们分析一下菌种衰退的原因，然后再介绍自然选育的一般方法。
一、菌种衰退原因的分析
菌种的生产能力决定于菌种的遗传特性和菌种的生理状态。菌种衰退的原因也包括这两个方面。
（一）菌种遗传特性的改变
导致菌种遗传特性改变的遗传学机理有三个方面：异核现象、自发突变和回复突变。①异核现象：某些菌丝在生长时会和邻近的菌丝细胞间发生融合，形成异核菌丝体（简称异核体），即在一条菌丝里含有几个遗传特性不同的细胞核，共同生活在均一的细胞质里。异核体可以由遗传特性不同的菌丝融合后形成。异核体所产生的单核或多核的孢子具有不同的遗传特性和不同的生长繁殖速度，其结果是伴随着菌种的传代培养，菌种的遗传特性发生改变。②自发突变：由于DNA在复制过程中会出现偶然的差错，以及环境中某些物质和某些微生物自身的代谢产物对微生物有微弱的诱变作用，菌种以很低的频率发生自发突变，导致菌种遗传特性改变。③回复突变：突变所产生的变种或杂交重组所形成的***往往不稳定，容易发生回复突变或产生分离子，以致在菌种这一群体中形成具有不同基因型的个体。 以上是导致菌种变异的遗传学机理。这些易导致菌种衰退的变异，通过菌种所处的环境因素的影响得以表现。生产过程中，菌种传代的次数过多和菌种保藏条件不良均会导致菌种衰退性变异。生产菌种需要传代培养。虽然原始斜面菌种是由单菌落发育而来，但斜面培养物的个体具有不同的遗传特性，所有菌种的性状实际上是菌种群体的特征。群体较纯的，传代后变异较少；群体不纯的，传代后变异多。菌种传代次数越多，菌种衰退变异越严重。虽然基因突变具有不定向性，有减低产量的负变异，也有提高产量的正变异，但是对于一个产量较高的生产菌种而言，出现负变异的几率更高些，更重要的是传代培养具有某种富集负突变株的选择作用，导致整个菌种群体生产性能的衰退。生产中我们通常所说的菌种优良性状是和大量生产发酵产物有关的，高产菌株往往表现出活力弱、生长繁殖速度慢的特点。高产菌种负变异出现几率高和生长繁殖慢的特点，使得传代培养实质上具有使菌种群体负变异个体增多，使菌种的生产能力衰退。此外，菌种保藏过程中采用的一些手段，例如冷冻干燥，会对菌体细胞结构和DNA造成损伤，在修复这些损伤时，菌体可能发生变异。因此，菌种保藏条件不良也会使得菌种衰退性变异。
（二）菌种生理状况的改变
菌种的遗传特性需要在一定条件下才能表现出来，菌种的培养条件对菌种的发酵产量也会有重大影响。由于培养条件不适当，使菌种处于不利于发酵生产的生理状况，其结果也表现为菌种衰退。菌种培养条件影响菌种发酵产量有以下三方面的原因：①菌种培养基的性质可影响菌落类型的比例，进而影响发酵产量。一个菌种不是纯一的群体，而是由一些变异菌株混合组成，这些变异菌株所占的比例决定该菌种的特性。一个由单菌落发育而来的菌种分离在固体培养基上，可以长出许多种形态培养特征各异的菌落。这些不同的菌落类型在代谢和生长繁殖速度等方面有一定差异。培养基的性质可以影响各菌株在培养物中的比例而改变菌种特性。最显著的实例是同一个菌种在不同的固体培养基上培养，所生长出来的单菌落，其形态培养特征有显著差异，各种类型菌落所占的比例不同。灰色链霉菌在豌豆琼脂培养基上，有3~4种菌落类型，而在黄豆粉培养基上仅出现两种菌落类型。在开始菌种选育工作时，要研究用于分离单菌落的分离培养基，找出能呈现较多菌落类型的分离培养基。菌落类型和发酵产量之间有相关性。在育种实践中，人们经过对菌落特征的考察，有意识地丢弃一些低产的菌落类型，挑选那些可能为高产的菌落类型。②菌种培养基通过影响菌种的生理状况而影响发酵产量。菌种培养基的营养过于丰富不利于孢子形成也不利于发酵。菌种培养基的营养贫乏也同样不利于发酵，因为菌种在营养贫乏的培养基中多次传代，会使菌体细胞内缺乏某些生长因子而衰老甚至死亡。因此，自然选育或菌种培养所用的培养基，应选择具有传代后生产能力下降不明显，菌体不易衰老，以及正常类型菌落丰富等优点的培养基。③菌种培养基中含有诱导剂或阻遏物，使菌体的某些与发酵产量有关的基因处于活化状态或阻遏状态。这样一种生理状态的菌种，即使转移至发酵培养基中，其基因的活化状态或阻遏状态可能以类似生理性迟延或细胞分化的机制保持较长一段时间而影响发酵产量。
二、 自然选育基本方法
常用的自然选育方法是单菌落分离法。把菌种制备成单孢子悬浮液或单细胞悬浮液，经过适当的稀释后，在琼脂平板上进行分离。然后挑选单个菌落进行生产能力测定，从中选出优良的菌株。采用单菌落分离法有时会夹杂一些由两个或多个相邻的孢子所长成的菌落。另外不同孢子的芽管间发生吻合，也可形成异核菌落。要克服这些缺点，就要特别重视单孢子悬浮液的制备方法。为使单孢子悬浮液有良好的分散度，力求去除菌丝断片或粘接在一起的成串的孢子，可采用如下方法制备单孢子悬浮液：①对于细菌，因其在固体斜面培养基上常粘在一起，故要求转种到新鲜肉汤液体中进行培养，以取得分散且生长活跃的菌体；②对放线菌和霉菌的孢子，采用玻璃珠或石英砂震荡打散孢子后，用滤纸或棉花过滤。对某些粘性大的孢子，常加入0.05%的分散剂（如Tween80），以获得分散的单个孢子。
第二节 诱变育种
诱变育种是通过诱变剂处理提高菌种的突变几率，扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌株。诱变育种和其他育种方法比较，具有速度快、收效大、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种重要方法。在生产中应用得十分普遍。但是诱发突变缺乏定向性，因此诱发突变必须与大规模的筛选工作相配后才能收到良好的效果。
以下分别叙述诱变育种工作流程和诱变育种工作中的三个重要环节：突变的诱发、突变株的筛选 突变基因的表达。
一、诱变育种的工作流程
诱变育种的工作流程：出发菌种 （沙土管或冷冻管）®斜面（或肉汤培养24小时）®单孢子悬液 （或细菌悬液）®诱变处理 （处理前后的孢子液或细菌悬液活菌计数）®涂布平板®挑取单菌落传种斜面®摇瓶初筛®挑出高产斜面®留种保藏菌种®传种斜面®摇瓶复筛®挑出高产菌株作稳定性试验和菌种特性考察®放大试验罐中试考察®大型投产实验。整个流程按诱变过程和筛选过程两部分说明如下：
（一）诱变过程
由出发菌种开始，制出新鲜孢子悬浮液（或细菌悬浮液）作诱变处理，然后以一定稀释度涂布平板，至平板上长出单菌落为止的各步骤为诱变过程。简述如下：
（1）菌种的斜面 出发菌种的斜面非常重要，其培养工艺最好是经过试验已知的最佳培养基和培养条件。要选取对诱变剂最敏感的斜面种龄，要求孢子数量适中。
（2）单孢子悬浮液制备 （见第一节）
（3）孢子计数 诱变处理前后的孢子悬液要孢子计数，以控制孢子悬液的孢子数和统计诱变致死率，常用于诱变处理的孢子悬液浓度为105~108个孢子/毫升。孢子计数采用血球计数法在显微镜下直接计数。诱变致死率采用平板活菌计数来测定。
（4）单菌落分离 平皿内倾入20毫升左右的培养基，凝固后，加入一定量经诱变处理的孢子液（以控制每一平皿生长10~50个菌落为合适的量），用刮棒涂布均匀后进行培养。
（二）筛选过程
诱变处理的孢子，经单菌落分离长出单菌落后，随机挑选单菌落进行生产能力测定。每一被挑选的单菌落传种斜面后，在模拟发酵工艺的摇瓶中培养，然后测定其生产能力。筛选过程主要包括传种斜面、菌株保藏和筛选高产菌株这三项工作。
（1）传种斜面 主要挑选生长良好的正常形态的菌落传种斜面，并可适当挑选少数形态或色素有变异的菌落。经诱变处理，形态严重变异的往往为低产菌株。
（2）留种保藏菌种 经筛选挑出的比对照生产能力高10%以上的菌株，要制成沙土管或冷冻管留种保藏。留种保藏菌种这一步骤很重要，有此一步可保证高产菌株不会得而复失，复筛结果比较可靠也符合生产过程的特点。
（3）筛选高产菌株 诱变处理后的孢子传种斜面后，进行生产能力测试筛选。为了获得优良菌株，初筛菌株的量要大，发酵和测试的条件可粗放一些。例如可以采用琼脂块筛选法进行初筛，也可以采用一个菌株进一个摇瓶的方法进行初筛。随着以后一次一次的复筛，对发酵和测试的要求应逐步提高，复筛一般每个菌株进3～5个摇瓶，如果生产能力继续保持优异，再重复几次复筛。初筛和复筛均需有出发菌株作对照以比较生产能力是否优良。复筛后，对于有发展前途的优良菌株，可考察其稳定性、菌种特性和最适培养条件等。
诱变形成的高产菌株的数量往往小于筛选的实验误差，这是筛选工业生产高产菌株时常见的情况。因为真正的高产菌株，往往需要经过产量提高的逐步累积过程，才能变得越来越明显。所以有必要多挑选一些出发菌株进行多步育种，以确保挑选出高产菌株。反复诱变和筛选，将会提高筛选效率，可参考如下速度快、效果好的筛选工作步骤：①将出发菌株诱变处理；②平板分离200株单孢子菌株；③摇瓶初筛挑50株高产菌株；④摇瓶复筛挑5株高产菌株为下一轮的出发菌株；⑤将5 株出发菌株诱变处理；⑥平板分离各出发菌株，各挑40株菌株（共200株）；⑦再次采用初筛挑50株、复筛挑5株的同样方式进行诱变和筛选。
二、突变的诱发
突变的诱发受到菌种的遗传特性、诱变剂、菌种的生理状态以及诱变处理时环境条件的影响。
（一）出发菌株的选择
出发菌株就是用来进行诱变试验的菌株。出发菌株的选择是诱变育种工作成败的关键。出发菌株的性能，如菌种的纯一性、菌种系谱、菌种的形态、生理、传代、保存等特性，对诱变效果影响很大。挑选出发菌株有如下几点经验。
1． 选择纯种作为出发菌株
选择纯种作为出发菌株就是选择遗传性状稳定的菌株为出发菌株。采用纯种可以排除异核体的影响，获得较好的育种效果。在柱晶白霉素产生菌选育过程中，采用不纯的出发菌株，经过36代诱变，发酵单位提高幅度不大，仅由30u/m1提高到2000～2500u/m1。而采用去除异核体的纯出发菌株后，经过32代诱变，可由30u/m1提高到12000u/m1。选择纯种作为出发菌株，从宏观上讲，就是要选择发酵产量稳定、产量波动范围小的菌株为出发菌株。如果出发菌株遗传性不纯．可以先用自然分离或用缓和的诱变剂进行处理，取得纯种作为出发菌株。这样虽然要花一些时间，但育种效果更好。
2． 选择遗传特性好的菌株为出发菌株
选择出发菌株，不仅是选产量高的．还应该考虑其他与生产工艺、产品质量有关的因素，如产孢子多，色素少，生长速度快等有利于发酵产物合成的性状。特别重要的是选择的出发菌株应当具有我们所需要的代谢特性。例如，适合补料工艺的高产菌株是从糖、氮代谢速度较快的出发菌株得来的。用生命力旺盛而发酵产量又不很低的形态回复突变株作为出发菌株，常可收到好的效果。
3．选择对诱变剂敏感的菌株为出发菌株
选择对诱变剂敏感的菌株作为出发菌株，不但可以提高变异频率，而且高产突变株的出现几率也大。生产中经过长期选育的菌株，有时会对诱变剂不敏感。在此情况下，应设法改变菌株的遗传型，以提高菌株对诱变剂的敏感性。杂交、诱发抗性突变和采用大剂量的诱变剂处理均能改变菌株的遗传型而提高菌株对诱变剂的敏感性。
（二）诱变剂的选择
诱变剂的选择主要是根据已经成功的经验。诱变作用不但决定于诱变剂，还与出发菌株的遗传背景有关。一般对于遗传上不稳定的菌株，可采用温和的诱变剂，或采用已见效果的诱变剂；对于遗传上较稳定的菌株则采用强烈的、不常用的、诱变谱广的诱变剂。要重视出发菌株的诱变系谱。不要经常采用同一种诱变剂反复处理，以防止诱变效应饱和；但也不要频频变换诱变剂，以避免造成菌种的遗传背景复杂，不利于高产菌株的稳定。
选择诱变剂时，还应该考虑诱变剂本身的特点。例如紫外线主要作用于DNA分子的嘧啶碱基，而亚硝酸则主要作用于DNA分子的嘌呤碱基。紫外线和亚硝酸复合使用，突变谱宽、诱变效果好。
关于诱变剂的最适剂量，有人主张采用致死率较高的剂量，例如采用90%～99.9%致死率的剂量，认为高剂量虽然负变株多，但变异幅度大；也有人主张采用中等剂量，例如致死率75%～80%或更低的剂量，认为这种剂量不会导致太多的负变株和形态突变株，因而高产菌株出现率较高。更为重要的是，采用低剂量诱变剂可能更有利于高产菌株的稳定。
(三)影响诱变效果的因素
除了出发菌株的遗传特性和诱变剂会影响诱变效果之外，菌种的生理状态、被处理菌株诱变前的预培养和诱变后的培养条件以及诱变处理时的外界条件等都会影响诱变效果。
菌种的生理状态与诱变效果有密切关系，例如碱基类似物、亚硝基胍(NTG)等只对分裂中的DNA有效，对静止的或休眠的孢子或细胞无效；而另外一些诱变剂，如紫外线、亚硝酸、烷化剂、电离辐射等能直接与DNA起反应，因此对静止的细胞也有诱变效应，但是对分裂中的细胞更有效。因此，放线菌、真菌的孢子在诱变前稍加萌发可以提高诱变率。
诱变处理前后的培养条件对诱变效果有明显的影响。可有意地于培养基中添加某些物质（如核酸碱基、咖啡因、氨基酸、氯化锂、重金属离子等等）来影响细胞对DNA损伤的修复作用，使之出现更多的差错，而达到提高诱变率的目的。例如菌种在紫外线处理前，在富有核酸碱基的培养基中培养，能增加其对紫外线的敏感。相反，如果菌种在进行紫外线处理以前，培养于含有氯霉素(或缺乏色氨酸)的培养基中，则会降低突变率。紫外线诱变处理后，将孢子液分离于富有氨基酸的培养基中，则有利于菌种发生突变。
诱变率还受到其他外界条件，例如温度、氧气、pH、可见光等的影响。
三、突变株的筛选
菌体细胞经诱变剂处理后，要从大量的变异菌株中，把一些具有优良性状的突变株挑选出来，这需要有明确的筛选目标和筛选方法，需要进行认真细致的筛选工作，育种工作中常采用随机筛选和理性化筛选这两种筛选方法。
(一) 随机筛选
随机筛选即菌种经诱变处理后，进行平板分离，随机挑选单菌落，从中筛选高产菌株。为了提高筛选效率，常采用下列方法：
1.摇瓶筛选法
这是生产上一直使用的传统方法。即将挑出的单菌落传种斜面后，再由斜面接入模拟发酵工艺的摇瓶中培养，然后测定其发酵生产能力。选育高产菌株的目的是要在生产发酵罐中推广应用，因此摇瓶的培养条件要尽可能和发酵生产的培养条件相近。但是实际上摇瓶培养条件很难和发酵罐培养条件相同。
摇瓶筛选的优点是培养条件与生产培养条件相接近，但工作量大、时间长、操作复杂。
2.琼脂块筛选法
这是一种简便、迅速的初筛方法。将单菌落连同其生长培养基(琼脂块)用打孔器取出，培养一段时间后，置于鉴定平板以测定其发酵产量。琼脂块筛选法的优点是操作简便、速度快。但是，固体培养条件和液体培养条件之间是有差异的，利用此法所取得的初筛结果必须经摇瓶复筛验证。
3.筛选自动化和筛选工具微型化
近年来，在研究筛选自动化方面有很大进展、筛选实验实现了自动化和半自动化，省去了繁琐的劳动，大大提高了筛选效率。筛选工具的微型化也是很有意义的，例如将一些小瓶子取代现有的发酵摇瓶，在固定框架中振荡培养，可使操作简便，又可加大筛选量。但筛选工具微型化的实验结果的准确性还有待提高。
（二）理性化筛选
传统的菌种选育是采用随机筛选的方法。由于正变株出现的几率小，产量提高的范围通常在生物学波动的范围内，因而选出一株高产菌株需要耗费大量的人力、物力。而且，随着发酵产量不断提高，用随机筛选方法获得高产菌株的几率越来越小。近年来，随着遗传学、生物化学知识的积累，人们对于代谢途径、代谢调控机制了解得更多了，因而筛选方法逐渐从随机筛选方法转向理性化筛选方法。理性化筛选（rational screening）是运用遗传学、生物化学的原理，根据产物已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用一些筛选方法，以打破微生物原有的代谢调控机制，获得能大量形成发酵产物的高产突变株。
微生物的代谢产物不同，其筛选方法也有所不同。
1． 初级代谢产物高产菌株的筛选
初级代谢产物是和微生物的生长、繁殖直接有关的一类代谢产物，它们是组成细胞的各种大分子化合物或辅酶的基本成分。氨基酸、核苷酸、维生素是发酵工业中最常见的初级代谢产物。
根据代谢调控的机理，氨基酸、核苷酸、维生素等小分子初级代谢产物的合成途径中普遍存在反馈阻遏或反馈抑制。这对于产生菌本身是有意义的，因为可避免合成过多的代谢物而造成能量的浪费。但是，在工业生产中，需要产生菌产生大量的氨基酸、核苷酸、维生素。因此，需要打破微生物原有的反馈调节。
要使微生物大量地积累初级代谢产物，最重要的是需打破反馈抑制调节。降低终产物浓度和抗反馈突变的育种是打破反馈抑制调节的重要措施。
（1）降低终产物浓度 降低终产物浓度有两种方法可以达到此目的：①选育终产物的营养缺陷型菌株，在培养基中供给限量的终产物使该菌株能生长，但不致造成反馈调节，因而积累大量中间代谢产物。假设一代谢产物的生物合成途径为：A→B→C→D→E。 B、C、D为该代谢途径的中间代谢产物,E为该代谢途径的终产物。E作为终产物，通常对催化该代谢途径第一步反应的酶有反馈抑制作用。如果通过诱变处理使得C→E代谢途径中断，则为E的营养缺陷型，就可以避免终产物E对催化该代谢途径第一步反应的酶的反馈调节，使得原本不能大量积累的中间代谢产物C能够大量积累。②筛选细胞膜透性改变的突变株，使之大量分泌终产物，以降低细胞内终产物浓度，从而避免终产物反馈调节。例如，用谷氨酸棒杆菌的生物素营养缺陷型进行谷氨酸发酵，生物素是合成脂肪酸所必需的，而脂肪酸又是组成细胞膜类脂的必要成分。该缺陷型在生物素处于限量的情况下，不利于脂肪酸的合成，因而使细胞膜的透性发生变化，有利于将谷氨酸分泌至菌体细胞外的发酵液中。如果使用油酸缺陷型菌株或者甘油缺陷型菌株，即使在生物素过量的条件下，也可使谷氨酸在体外的发酵液中大量积累。
(2) 筛选抗反馈突变菌株 ①筛选结构类似物(抗代谢物)抗性突变株：分离抗反馈突变菌株最常用的方法是用与代谢产物结构类似的化合物(结构类似物)处理微生物细胞群体，杀死或抑制绝大多数菌体细胞，选出能大量产生该代谢物的抗反馈突变株。结构类似物一方面具有和代谢物相似的结构，因而具有和代谢物相似的反馈调节作用，阻碍该代谢物的生成；另一方面它不同于代谢物，不具有正常的生理功能，对菌体细胞的正常代谢有阻碍作用，会抑制菌的生长或导致菌的死亡。例如，一种氨基酸终产物，在正常的情况下，参与蛋白质合成，过量时可抑制或阻遏它自身的合成酶类。如果这种氨基酸的结构类似物也显示这种抑制或阻遏，却不能用于蛋白质的合成，那么当用这种结构类似物处理菌种时，大多数菌体细胞将由于缺少该种氨基酸而不能生长或者死亡，只有那些对该结构类似物不敏感的突变株，仍然能够合成该种氨基酸而继续生长。某些菌株所以能抵抗这种结构类似物，是因为被该氨基酸(或结构类似物)反馈抑制的酶的结构发生了改变（抗反馈抑制），或者被阻遏的酶的生成系统发生了改变（抗反馈阻遏）。由于突破了原有的反馈调节系统，这些突变株就可产生大量的该种氨基酸。②利用回复突变筛选抗反馈突变菌株：经诱变处理出发菌株，先选出对产物敏感的营养缺陷型，再将营养缺陷型进行第二次诱变处理得到回复突变株。筛选的目的不是要获得完全回复原状的回复突变株，而是希望经过两次诱发突变，所得的回复突变株有可能改变了产物合成酶的调节位点的氨基酸的顺序，使之不能和产物结合，因而不受产物的反馈抑制。例如，谷氨酸捧杆菌的肌苷酸脱氢酶的回复突变株对其终产物鸟苷酸的反馈调节不敏感，从而提高了鸟苷酸的产量。
2．次级代谢产物（主要是抗生素）高产菌株的筛选
次级代谢是某些生物为了避免在初级代谢过程中某些中间产物积累所造成的不利作用而产生的一类有利于生存的代谢类型。次级代谢有不同于初级代谢的特点，因此其筛选方法和初级代谢略有不同。次级代谢产物不是菌生长、繁殖所必需的，往往不能简单地采用筛选营养缺陷型或结构类似物抗性菌株的方法来获得高产菌株。次级代谢又受到初级代谢的调节，次级代谢和初级代谢有一些共同的中间产物，这些中间产物可以进而合成初级代谢产物，也可以进而合成次级代谢产物，这取决于菌的遗传特性和生理状态。微生物的代谢调节系统趋向于平衡地利用营养物质。当环境中某些营养物质过剩，而某些营养物质缺乏时，菌体为了避免不平衡生长而导致死亡，在代谢调节系统作用下，菌的生长繁殖速率下降，并通过代谢途径的改变将过剩的营养物质转变成与生长繁殖无关的次级代谢产物。因此，筛选某些营养缺陷型或初级代谢产物结构类似物抗性菌株可以消除初级代谢产物对那些与初级代谢产物有共同中间产物的次级代谢产物合成的反馈调节，而有利于次级代谢产物的合成。次级代谢产物的生物合成受终产物反馈调节的影响较小而受分解代谢物调节的影响较大。大多数菌在被快速利用的碳、氮、磷源消耗至一定程度时才出现有活性的次级代谢酶，因此筛选解除分解代谢调节的突变株可以获得高产。
次级代谢产物高产菌株的筛选方法有许多种，以下介绍八种较为常用的筛选方法：
（1）利用营养缺陷型筛选 抗生素产生菌的营养缺陷型大多为低产菌株，但是如果某些次级代谢和初级代谢处于同一分枝合成途径时，筛选初级代谢产物的营养缺陷型常可使相应的次级代谢产物增产。例如，芳香族氨基酸营养缺陷型可以增产氯霉素，芳香族氨基酸和氯霉素的生物合成途径中有一个共同的中间代谢物莽草酸，当诱变处理使莽草酸 → 芳香族氨基酸的生物合成出现遗传性阻碍时，菌体不能够合成芳香族氨基酸，从而避免了芳香族氨基酸对莽草酸生物合成的反馈调节，莽草酸得以大量合成，进而合成大量的氯霉素。同样的道理，脂肪酸和制霉菌素、四环素、灰黄霉素有共同的中间代谢物丙二酰辅酶A，脂肪酸营养缺陷型可以增产上述的抗生素。类似的例子还有头孢菌素产生菌的亮氨酸营养缺陷型可增产头孢菌素C，亮氨酸和缬氨酸有共同的中间代谢物α-酮基异戊酸，亮氨酸营养缺陷型使得缬氨酸的生成量增加，缬氨酸作为头孢菌素C合成的前体物质，参与头孢菌素C母核的合成，所以亮氨酸营养缺陷型可以提高头孢菌素C的发酵产量。一般来说，氨基酸营养缺陷型不适合工业发酵生产的要求，将这种氨基酸营养缺陷型和生产菌株(或另一种营养缺陷型)杂交或者回复突变，可能得到适合于工业生产的高产菌株。因为这样的杂交后代或回复突变株，可能既保留了营养缺陷型的代谢优点(生成较多的抗生素前体)，又便于发酵生产的控制(不需要另外补充相应的营养物质)。而且，还可能通过杂交或回复突变获得具有和抗生素合成有关的基因的部分二倍体。
筛选渗漏缺陷型是一种值得重视的方法．所谓渗漏缺陷型是遗传性障碍不完全的营养缺陷型。突变使某一种酶的活性下降而不是完全丧失，所以这种营养缺陷型能够少量地合成某一代谢产物，能在基本培养基上少量地生长。由于渗漏缺陷型不会合成过多的终产物，所以不会造成反馈调节而影响中间代谢物的积累。大多数抗生素高产菌株的生长速率低于野生型菌株的生长速率，似乎可以认为它们在某种意义上属于渗漏缺陷型。生长速率降低可能有利于抗生素合成，在产生菌生长迅速的时期不能大量积累次级代谢产物。根据以上的推理，可设计如下筛选过程：先进行摇瓶发酵试验，选出对抗生素发酵产量有明显影响的初级代谢产物。据此诱变出相应的营养缺陷型，然后再诱发回复突变或将野生型菌株诱变成另一营养缺陷型，再与之杂交。如欲筛选渗漏缺陷型，则把营养缺陷型接种在基本培养基上，这上面出现的菌落是回复突变株，其中长得特别小的菌落可能是渗漏缺陷型。
(2)筛选负变株的回复突变株 选择经过诱变处理后抗生素生产能力明显降低或完全丧失，但其他性状仍近于正常的突变株作为实验材料，进行诱变，再挑选高产菌株。因为两次诱变都作用于和抗生素生物合成有关的基因上。动摇了抗生素合成的遗传基础。用此方法得到的突变株，其抗生素合成有关的酶受调节的程度，往往低于原出发菌株。此外，从负变株中筛选回复突变株也比较容易，因为负变株没有发酵产量或发酵产量很低，便于从中检出有较高抗生素产量的回复突变株。
(3)筛选去磷酸盐调节突变株 磷酸盐对许多抗生素的生物合成有抑制作用，筛选去磷酸盐调节突变株对于生产抗生素是很有意义的。因为要提高抗生素的产量，既要使产生菌生长到一定的量，又要使产生菌产生较多的抗生素。这样培养基中必须加入一定量的磷酸盐，以供菌体生长的需要，但茵体生长所需要的磷酸盐浓度往往对抗生素生产有抑制作用，去磷酸盐调节突变株可消除或减弱这种抑制作用以获得高产。
为了筛选到去磷酸盐调节菌株，可设计如下筛选方法:①筛选能在磷酸盐抑制浓度条件下，正常产生抗生素的突变株：将孢于悬浮液诱变处理后，将孢子接种于完全培养基上，使突变株得以表达，再由完全培养基上的菌落影印接种于发酵培养基(含正常浓度的磷酸盐、加琼脂)，待菌落长出后，用打孔器把长有单个菌落的琼脂块转移到一张浸有高浓度磷酸盐的滤纸上培养、发酵，然后生物检定其抑菌活力。抑菌活力明显大于其它菌落的可能就是去磷酸盐调节突变株。从影印平板桃取相应的菌落，摇瓶发酵测定抗生素产量。②筛选磷酸盐结构类似物(如砷酸盐，钒酸盐)抗性突变株：磷酸盐结构类似物对菌体细胞具有毒性，其抗性菌株可能对磷酸盐调节不敏感。例如，钒酸钠是一种ATP酶的抑制剂。粗糙脉孢菌的细胞内有两种磷酸盐转运系统：一是低亲和力的磷酸盐转运系统Ⅰ，一是高亲和力的磷酸盐转运系统Ⅱ。钒酸钠抗性突变缺失磷酸盐转运系统Ⅱ，因而避免了过多地吸收钒酸钠而导致菌的死亡，同时也避免了过多地吸收磷酸盐而导致磷酸盐抑制。
(4)筛选去碳源分解代谢调节突变株 能被菌快速利用的碳源在被快速分解利用时，往往对许多其他代谢途径中的酶(包括许多抗生素合成酶和其他的酶)有阻遏或抑制作用，成为抗生素发酵产量的限制因素，不利于发酵生产工艺的控制。筛选去碳源分解代谢调节突变株，对于提高抗生素发酵产量，简化发酵生产工艺具有重要意义。抗生素生产中最常见的碳源分解代谢调节是“葡萄糖效应”，葡萄糖被快速分解代谢所积累的分解代谢产物在抑制抗生素合成的同时也抑制其他某些碳、氮源的分解利用。因此，可利用这些碳(或氮)源作为唯一可供菌利用的碳（或氮）源，进行抗葡萄糖分解代谢调节突变株的筛选。例如，将菌在含有葡萄糖(阻遏性碳源)和组氨酸为唯—氮源的培养基中连续传代后，可选出去葡萄糖分解代谢调节突变株。正常的组氨酸分解酶类是被葡萄糖分解代谢物阻遏的，如果突变株能在这种培养基中生长，说明它具有能分解组氨酸而获得氮源的酶。这样的结果，可有两种解释：第一种解释是组氨酸分解酶发生了突变，不再受到原有的分解代谢物阻遏；第二种解释是葡萄糖分解代谢有关的酶发生了突变，不再产生或积累那么多的分解代谢阻遏物。第二种解释符合许多去葡萄糖分解代谢调节突变株的特性，因为同时有许多酶（受分解代谢调节的酶）的生成都不再受到葡萄糖分解代谢物阻遏。这种现象也是我们在抗生素育种工作中选择这种方法筛选去碳源分解代谢调节突变株的依据。
葡萄糖的毒性结构类似物也可用于筛选去碳源分解代谢调节突变株。例如，以半乳糖作为可供菌生长利用的唯一碳源，再于培养基中添加葡萄糖的毒性结构类似物D—2—去氧葡萄糖。D—2—去氧葡萄糖不能为菌所利用，但可抑制菌利用半乳糖。所以，在这种培养条件下，只有去葡萄糖分解代谢调节突变株能够利用半乳糖进行生长，原始菌株由于不能利用半乳糖而不能生长，因而可选出去碳源分解代谢调节突变株。
筛选去碳源分解代谢调节突变株还应注意避免走向另一个极端，即片面追求葡萄糖分解代谢速率下降，因为保持合适的葡萄糖分解代谢速率是抗生素高产的关键。
此外，筛选淀粉酶活性高的突变株，以利于在发酵培养基中增加淀粉类物质作为补充碳源，也可以减弱碳分解代谢调节对抗生素生产的抑制作用。
(5)筛选氨基酸结构类似物抗性突变株 许多抗素和氨基酸有共同的前体或者有些氨基酸本身可以作为某些抗生素的前体。因此，氨基酸的代谢和抗生素合成有着密切的联系，打破菌种对氨基酸代谢的调节，可能导致抗生素高产。
在培养基中加入氨基酸结构类似物，氨基酸结构类似物对菌的生长有抑制作用，因此可以筛选到解除了氨基酸反馈调节的突变株。这些突变株能够在含有氨基酸结构类似物的培养基中生长，抗性的机制可能在于生成较多的氨基酸，从而提高抗生素前体的量。例如，在青霉素生物合成途径中，半胱氨酸和缬氨酸是青霉素母核的前体。筛选抗半胱氨酸结构类似物或抗缬氨酸结构类似物的抗性突变株，可以提高半胱氨酸或缬氨酸的生成量，进而提高青霉素产量。又如赖氨酸和青霉素有共同的中间代谢产物α-氨基己二酸，筛选抗赖氨酸结构类似物抗性突变株，可以解除赖氨酸对α-氨基己二酸生成的反馈调节，使α-氨基己二酸生成量增加而促进青霉素合成。
筛选方法：将菌种诱变处理，接种于含抑制浓度的氨基酸结构类似物的培养基中，由于此种培养条件使得正常菌株不能生长，而抗氨基酸反馈调节的突变株或其他抗性突变株能够生长。因此可筛选出氨基酸结构类似物抗性突变株。在实际操作过程中，有许多氨基酸结构类似物并不抑制菌的生长，或只有在高浓度时才抑制菌的生长，因此要选择合适的氨基酸结构类似物用于筛选。还有一些氨基酸结构类似物仅抑制菌落的生长和减少孢子的数量，但高浓度时不抑制菌落形成和孢子形成，在此情况下，正常大小或正常产孢子的菌落被视为抗性菌。还可以用加入抗代谢抑制剂(如多烯类抗生素)方法，使细胞膜透性改变而提高筛选效果(排除一部分因细胞膜透性改变而具有抗性的突变株和提高菌体细胞对氨基酸结构类似物的敏感性)。
筛选二价金属离子抗性突变株 加入能和产物(抗生素)或其中间体结合的生长抑制剂(二价金属离子)，抑制剂达一定浓度，抗生素低产菌株不能生长而高产菌株能够幸存下来，因而可能筛选到高产菌株。抗性的机制为形成大量产物或中间体和二价金属离子结合以解除二价金属离子对产生菌的毒性。但是用此方法，细胞膜透性改变而对二价金属离子具有抗性的菌株也会存留下来，需要进一步进行摇瓶筛选，通过抗生素产量的比较去除那些并不高产的抗性突变株。
采用上述方法曾筛选出青霉素和杆菌肽等抗生素的高产菌株。杆菌肽能和二价金属离子结合，具有输送二价金属离子进出细胞的生理功能。选育杆菌肽高产菌株时，于培养基中添加适量的硫酸亚铁，在此条件下筛选到的抗性菌株多数表现出高产的特性。其可能的抗性机理是：产生菌形成大量的杆菌肽和二价铁离子结合，将二价铁离子送出细胞外，从而避免了二价铁离子对产生菌的毒性作用。
(7)筛选前体或前体结构类似物抗性突变株 前体或前体结构类似物对某些抗生素产生菌的生长有抑制作用，且可抑制或促进抗生素的生物合成。筛选对前体或前体结构类似物的抗性突变株，可以消除前体或前体结构类似物对产生菌的生长及其抗生素合成的抑制作用，提高抗生素量。例如，灰黄霉素发酵使用氯化物为前体，筛选抗氯化物的突变株，提高了灰黄霉素的产量；以苯氧乙酸为青霉素前体，选用抗苯氧乙酸突变株，提高了青霉素v的发酵产量；以青霉素的前体缬氨酸、α—氨基己二酸或半胱氨酸、缬氨酸的结构类似物，筛选抗性菌株，提高了青霉素的发酵产量。
依据前体特性的不同，可将前体分为三种类型。其筛选抗性突变株的增产机理也有所不同。第一类前体是产生菌不能合成或很少合成的化合物。这一类前体通常需要人为地添加到发酵培养基中以促进提高抗生素产量或提高抗生素某一组分的产量。例如青霉素侧链前体苯氧乙酸、苯乙酸等。这一类前体通常对产生菌的生长具有毒性作用。对这些前体具有抗性的高产菌株可以通过高活性的酰基转移酶将前体掺入青霉素分子的侧链中。这样一种前体抗性突变株通过将前体转变成青霉素而解除了前体对产生菌的毒性，使产生菌在高浓度的毒性前体存在时也能生长。筛选这一类前体的抗性突变株应注意避免那些由于细胞膜透性下降使前体吸收减少的低产突变株或那些由于加强了对前体氧化分解的低产突变株。第二类前体是产生菌能够合成但不能大量积累的初级代谢中间产物。发酵生产中需要在发酵培养基中补充这一类前体以提高抗生素产量。例如红霉素发酵生产中添加丙醇以提高发酵产量。这一类前体物质过多会干扰产生菌的初级代谢而抑制菌的生长。抗性菌株的增产机理可能在于迅速将丙酸衍生物合成为红霉素，从而避免丙酸衍生物对初级代谢的干扰作用。第三类前体是初级代谢终产物。这一类前体一般对自身的生物合成有反馈调节作用，因而难以在细胞内大量积累。例如青霉素发酵生产中缬氨酸反馈抑制乙酰羟酸合成酶，从而抑制了缬氨酸的合成。筛选抗缬氨酸结构类似物抗性突变株，可使乙酰羟酸合成酶对缬氨酸反馈抑制的敏感性减弱，使细胞的内源缬氨酸的浓度增加而提高青霉素产量。
（8）筛选自身所产的抗生素抗性突变株 某些抗生素产生菌的不同生产能力的菌株对其自身所产的抗生素的耐受能力不同，高产菌株的耐受能力大于低产菌株。因此，可用自产的抗生素来筛选高产菌株。例如有人把金霉素产生菌多次移种到金霉素浓度不断提高的培养基中去，最后获得一株提高生产能力四倍的突变株。此方法在抗生素高产株选育中有广泛应用，青霉素、链霉素、庆大霉素等抗生素的产生菌均有用此方法来提高产量的例子。此方法还适用于进一步纯化高产菌株。
除了以上介绍的理性化筛选方法，用于菌种理性化筛选的，还有各种类型的突变株，如组成型突变株、消除无益组分的突变株、能有效利用廉价碳源或氮源的突变株、细胞形态改变更有利于分离提取工艺的突变株、抗噬菌体的突变株等等。这些突变株均有重大的经济价值，而且这些筛选目标虽然不以产量为唯一目标，但突变株所具有的优良特性却往往能导致产量的提高。例如红霉素生产中选育的抗噬菌体菌株，其红霉素产量表现出较大的变异范围，得到比原种产量高的突变株。这可能是由于发生了抗噬菌体突变后，动摇了菌种原有的遗传基础，使之更容易获得高产突变株。
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发表于 2015-5-10 12:58:50
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