一个样品，多个结果--运用多重PCR诊断感染性综合症

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一旦限制于研究和参考实验室，用于诊断感染性疾病的分子检测方法就成为了各种规模临床实验室常规检验流程的一部分。由于分子检验灵敏度和特异性更高，且大多数情况下比传统方法周期短，实验室和临床人员都积极接受了这种改变。鉴于在临床实践中，这种检验的接受度高，生产厂商开发了多种产品（从仪器设备到分析试剂盒）供实验室选择。该技术已从手动发展到了全自动，封闭系统能提供进样到出结果的全自动操作，这样实验室只需要有限的经验就可以开展分子检验。

许多研究已经证明了分子检验在检测某种特殊微生物[如艰难梭状芽胞杆菌或抗甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）]上的临床有效性。最近，该技术正在逐渐从检测一种特殊微生物发展为检测与感染性综合症相关的多种病原体。有多重能力的分子技术可能使用传统PCR技术或实时定量PCR和逆转录PCR技术来扩增目的片段。它们针对一个样本，同时检测与某种特殊感染性综合症（如脓毒病、脑膜炎/脑炎以及尿道、呼吸道或胃肠道感染）最常相关的一组病原体。

多重PCR分析的优点和局限性

当临床实验室可以流线型处理和检测样本时，这种新兴技术将重新定义感染疾病诊断并对患者管理产生重大影响。当临床样本难以获得或样本量有限（例如脊髓液），或当多种不同病原体能导致相同临床表现且临床医师难以判断致病菌时，这种可以在一个样本中检测多重目标的技术就显得尤其重要。

目前，在临床实验室中推广多重分子检测的障碍在于试剂盒成本高，以及需要多台仪器来分析不同传染性综合症。这种分析也有一些缺点。表一总结了多重PCR分析的可能优缺点。


然而，即便有局限性，多重PCR分析还是在临床实践上被迅速采用。我希望市场快速发展带来的竞争以及合理的补偿计划能使这种检测技术费用显著降低、检测目标增加以及自动化水平升高。只要能观察到临床效益，那么这种从单一到多重的分子分析模式转变就会持续下去。

本文接下来将关注多重PCR检验在以下感染性综合症领域的运用：血液、呼吸道和肠胃道感染。我们将讨论在每个类型的感染性综合症领域快速分子检测的需求，以及多重检测相比传统方法的优点和可能缺陷。此外，本文也将描述和比较用于诊断这些感染疾病的市售和美国食品药品监督管理局（FDA）批准的多重PCR分析技术。商业组——用于特定感染性综合症的多重PCR检验。

血液培养组

血液感染能引发全身炎症反应综合症，并可能发展为重度脓毒症和感染性休克。两个因素会导致血液感染患者死亡率大大增加：感染发展成脓毒症或感染性休克，和合适的抗菌治疗延误。此外，为了防止出现耐药性，临床医师必须尽早开始有效治疗且避免让患者过度接触广谱抗生素。出于所有这些原因，实验室快速鉴定病原菌以及耐药机制在选择合适疗法上是极其关键的，且是患者能否生存的一个决定性因素。

常规培养和药敏试验可能需要72小时才能出结果，而多重PCR分析可以在血液培养标记为阳性（使用血液培养设备）后1-3小时内出结果。假如在结果确认后迅速做出治疗方案，那么这种快速检测的好处就能呈现。因此，来自抗菌药物管理团队的支持对于实现具有成本效益的检测目标以及改善患者预后至关重要。

目前已经有两款经FDA批准的分子血液培养板：Biofire诊断生产的FilmArray血液培养鉴定板和Nanosphere生产的Verigene血液培养检测试剂盒。在对应系统检测来自阳性血液培养瓶的样品。样品准备、扩增和检测这3步反应都由设备自动完成。FilmArray分析试剂盒提供一个板来检测革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和酵母菌。Verigene分析试剂盒则根据革兰氏染色结果使用单独的板来检测革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。表2总结了每种血液培养板在某个时间点的详细检测结果和每种检测到的微生物组。

所有培养板的评估显示它们准确鉴定了最重要的血液感染原因，并比传统方法提供结果明显快得多。这样就能让医师及早制定合适的疗法。

病毒性呼吸道感染组

病毒检测也经历了从常规检验向分子检验的巨大转变。在所有年龄组中，呼吸道感染是造成生病和死亡的最常见原因，而不同微生物造成的临床表现比较相似，这就使只基于临床症状来准确预测致病原因变得不太可能。2009年爆发的H1N1流感清楚表明，对于患者和公共卫生部门来说，准确快速诊断由病毒引起的呼吸道感染十分重要。临床医师越来越清楚地认识到病毒性呼吸道感染不同于流感，它能造成严重后果，这就使病毒性呼吸道感染患者管理部门和监控部门对能检测最常见病原菌的快速综合性的多重PCR充满兴趣。然而，使用快速抗原流感检测时灵敏性的不稳定限制了它的临床使用。

目前，有许多针对流感的分子检测选择，包括一种FDA最新批准的即时检测。除了广泛使用的针对甲型流感（不论有没有子类型）、乙型流感和/或采集自鼻咽拭子的呼吸道合胞体病毒的分子检测，临床实验室越来越频繁地使用检测多种呼吸道病毒的多重PCR检测方法。在写这篇综述的时候，已经有4种FDA批准的多重分子呼吸道病毒检测试剂盒（RVP）。表3列举了这些检测试剂盒的性能。

分析方法不同，检测目标不同，灵敏性也会不同，但是所有列举的试剂盒包含的分析方法针对所有目标都有很高的特异性。每个实验室应当基于各自可用的设备、员工的经验和能力以及服务的患者群体大小决定哪个系统适合他们的特殊需求。

GI试剂盒
感染性腹泻可由细菌、病毒或寄生虫引起，目前依然是全球范围内一个重大的医疗负担。虽然大多数GI感染是自限性的，但它们依然很严重，在幼儿、老年人和免疫系统受损的人中甚至会致命。由于不能通过临床表型来确定病原体，临床医师通常进行细菌培养，同时对来自腹泻患者的粪便样本进行虫卵和寄生虫（O&P）检测。

然而，这种常规检测方法至少有3个重要的诊断局限性。首先，粪便中细菌性病原体的培养和鉴定是劳动密集型的，需要3-5天或更长的时间才能得到结果。此外，CDC推荐的针对粪便中志贺毒素的检测和培养增加了细菌培养的成本，而且在产生志贺毒素的大肠杆菌不流行的区域进行这项检测收益很小。其次，O&P检测灵敏度不高、太耗费时间，且需要训练有素的人员来进行有意义地解读和检测引起腹泻的寄生虫。第三，尽管病毒感染是GI疾病爆发的一个重要原因，但大多数实验室并不进行病毒培养或抗原检测（除非针对轮状病毒），因此这种感染不为人注意，而且可能会传播。

目前已有两个FDA批准的多重PCR分析产品（Hologic’sProGastro SSCS和BD MAX肠道细菌试剂盒）能检测粪便中的细菌性病原体。然而，由于几个重要原因，包括使额外检测最小化、快速控制感染源以减少传染、以及避免使用不必需的抗生素的可能性，对一种更全面、快速、灵敏度和特异性高的应用于感染性腹泻（不仅由细菌引起，也可由病毒或寄生虫引起的）诊断的检测方法的需求更为迫切。表4列举了3款这类型的FDA批准的GI检测试剂盒以及每种试剂盒针对的目标微生物。


这些检测有较高的灵敏度和特异性，而且也能检测常规粪便化验检测不到的病毒性病原体。GI试剂盒的临床和经济影响尚未完全评估。目前还有一些对分子检测的关注，主要是在一些病例中分子检测可能检测菌落群集而不是感染，这使得临床医师对于结果难以解释。随着越来越多的实验室使用GI试剂盒，我希望在不久的将来，这些试剂盒的临床功效和成本效率能展示出来。
结论

在感染疾病诊断领域，分子检测正在逐步取代传统方法。改进的设备和“样品到结果”全自动系统已经帮助临床实验室实行这种检测。最近，多重PCR分析（能在一个样品中检测大量目标）的有效使用改变了需要一系列单独实验来检测不同病原体的模式，多重PCR可以使用一个样品、一个检测就能对感染症状做出诊断。

当有来自抗生素监管团队（可以实时按照结果行动）的支持时，多重PCR检测在临床上能起到更大作用。相比传统方法，分子检测试剂盒的高成本阻碍了它们的广泛应用，但迅速的检测周期以及较高的灵敏度和特异性使之成为一种十分强大的工具。在临床实验室中，运用多重PCR检测节省的成本也许并不能直接体现，但快速诊断由于能减少停留的时间以及使患者有更好的预后，可以变相为社会机构节约成本。

英文原文：
One Sample, Multiple Results
The Use of Multiplex PCR for Diagnosis of Infectious Syndromes