西班牙蝙蝠中发现新型狂犬病毒

Sun

蝙蝠一直被认为是多种病毒的天然宿主，这些病毒包括人类病原体，如狂犬病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒、亨尼帕病毒（henipavirus）和线状病毒（floviruses）。在狂犬病毒属中已经报告了12种病毒：狂犬病毒（RABV）、拉各斯蝙蝠病毒（LBV）、莫科拉病毒（MOKV）、杜文黑基病毒（DUVV）、欧洲蝙蝠狂犬病毒1型和2型（EBLV－1和EBLV－2）、澳大利亚蝙蝠狂犬病毒（ABLV）、阿拉万病毒（ARAV）、苦盏病毒（KHUV）、伊尔库特病毒（IRKV）、西高加索蝙蝠病毒（WCBV）和希莫尼蝙蝠病毒（SHIBV）。还有最近发现的两种尚未分类的狂犬病毒：波克罗（Bokeloh）蝙蝠狂犬病毒（BBLV）和伊科马狂犬病毒(IKOV)。

蝙蝠是大部分狂犬病毒的天然宿主，而且据我们所知，只有MOKV和IKOV还从未在蝙蝠中检测出来。仅有RABV是唯一已知能同时在蝙蝠和食肉动物中建立流行病学循环的病毒，大多数人类感染是由该病毒引起（主要经狗传播）。狂犬病毒属至少分为两个遗传谱系：遗传谱系 I （RABV、 DUVV、EBLV1–2、ABLV、ARAV、IRKV、BBLV、KHUV）和遗传谱系 II (LBV、MOKV 和 SHIBV)。遗传谱系III 包括WCBV。根据最近的一项系统发生树重建研究，其中包括新的IKOV ，基于对其核蛋白的405个核苷酸基因片段分析，证明IKOV和前两种遗传谱系高度相异，可能也属于遗传谱系III。

从1977年至2011年，《欧洲狂犬病通报（Rabies Bulletin Europe）》共报告988例蝙蝠狂犬病。其中与大棕蝠（Eptesicus serotinus）和褐黄蝠（E. isabellinus）相关的病例占所有报告病例的95 ％以上，因此这两类蝙蝠被认为是EBLV－1的主要天然宿主。属于鼠耳蝙蝠属（Myotis）的几种蝙蝠则是EBLV – 2、BBLV和中亚狂犬病毒ARAV和KHUV 的储存宿主。在普通长翼蝠（Miniopterus schreibersii）中分离到WCBV。虽然在西班牙，正式公布感染蝙蝠狂犬病毒的只有褐黄蝠，但也存在其他种类的蝙蝠作为宿主的可能。对其他蝙蝠的自然栖息地的若干调查，发现有与EBLV－1相关的中和抗体和基因组片段，提示可能存在更广的宿主范围。

实验研究

2011年7月，莱里达地区发现一只蝙蝠并送到瓦坎棱特（Vallcalent，Lleida, Catalonia)野生动物保护中心。这只蝙蝠刚送到时已经脱水并处于昏迷状态，在送达不久后便死去；动物保护中心将其尸体置于－20°C保存。在2012年3月12日，在西班牙狂犬病毒监测活动中，西班牙国家微生物中心收到该蝙蝠尸体，并对其进行狂犬病检测。其检查方法包括两次通用逆转录PCR (RT－PCR)和两次商业检测狂犬病抗血清实验和免疫荧光实验。

将其脑组织涂片进行RT－PCR和免疫荧光实验，还将其喉部体液棉签蘸取样品进行RT－PCR，结果都呈阳性。随后尝试更进一步用组织培养分离病毒，并分别在BHK－21细胞和鼠神经母细胞瘤细胞中进行两次盲传，但都失败了。失败的原因可能是因为样本在－20°C环境中保存8个月期间经过两次解冻；然而不排除可能是使用的细胞系并不适合该病毒生长。

该蝙蝠根据形态和细胞色素b基因序列测定结果可判定是长翼蝠。通过BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ ）分析曾确定狂犬病毒核蛋白基因的保守区域；诊断性RT－PCR对相应片段的基因组进行序列测定，结果显示，没有实质性的序列与先前已知的狂犬病毒相似。

为确定该狂犬病毒的身份，我们测序了一个较大片段(565 bp），包括核蛋白基因的可变编码区（结果已提交GenBank）。我们对N基因的前405个核苷酸采用Bayesian Inference和MrBayes软件3.1.2版本（http://mrbayes.csit.fsu.edu/）进行分析，重建狂犬病毒的整体系统发生树。用两种方法同步推算106代，每代取4个马尔可夫链，每100代构建一个系统树。在MrBayes方法下根据校正后的Akaike信息准则可选定最合适的核苷酸模型GTR + I +G。系统发生树的重建是基于对所有已知的狂犬病毒(包括最近发现的IKOV)的数据。得到的拓扑结构表明，该序列和IKOV和WCBV关系更密切，而与遗传谱系I 和II的狂犬病毒关系较远（见附图）。这些结果表明，该序列可能属于一个新的狂犬病毒物种；以其发现地的名字命名，我们称其为莱里达蝙蝠狂犬病毒（ LLEBV ）。

LLEBV的核苷酸与IKOV同源性最高（71.6％），其次是SHIBV （68.6％）、 IRKV（68.1％）、 KHUV （67.6％）、 EBLV －2 （67％－68.2 ％）、 ARAV （67.3％）、WCBV （ 67.4 ％）、 ABLV （ 66.6 ％－67.7 ％）、 BBLV （ 66.1 ％）、 LBV （ 65.7％－68.6 ％）、 MOKV （ 65.7 ％－67.2 ％）、 DUVV （ 65.5 ％－65.8 ％）、 RABV（ 64.7 －66.4 ％）和EBLV －1（ 63.7 ％－64 ％）。核苷酸序列同源性最低的为同在伊比利亚半岛的蝙蝠中发现的唯一的狂犬病毒EBLV－1。这个特定的片段与先前已知的狂犬病毒的核苷酸同源性为63.5％－80.0 ％。属于同一种狂犬病毒的不同毒株间同源性最低的是ABLV（80.4％）和LBV（79.9 ％）（已有建议将差别最大的LBV株定义为不同的狂犬病毒）。  

结论

根据在西班牙东北部的长翼蝠中发现的狂犬病毒抗原反应性和相关的基因组序列资料，可能确定存在一种新病毒LLEBV。根据我们的系统发生树重建，该病毒似乎不属于遗传谱系I（该谱系包括大多数蝙蝠狂犬病毒），也不属于非洲的遗传谱系II。应当进一步确定LLEBV序列与WCBV和IKOV序列之间存在的进化关系，才能确定它们是否形成>1个不同遗传谱系。

值得注意的是，这个新LLEBV和WCBV一样来自长翼蝠，WCBV是在欧洲发现的不属于遗传谱系I的另一种狂犬病毒。传统上认为长翼蝠属于蝙蝠科，和欧亚大陆上与狂犬病毒相关的其他蝙蝠属相同（包括棕蝠、鼠耳蝠和管鼻蝠）。不过近期的基因分析已确认长翼蝠应当归类为长翼蝙蝠科。长翼蝠具迁飞习性，已广泛分布在欧洲南部及亚欧大陆。数以万计的长翼蝠在洞穴里越冬，到春季为了繁殖会飞到不同地方，甚至到达遥远的夏季栖息地。这种生态习性，使得感染因子很容易在其群体内或群体间快速传播。

因此，很难想象WCBV或LLEBV会被限制在局部地区，它们可能在远离它们被发现的地方存在。在非洲蝙蝠中曾发现有针对WCBV的中和抗体。近年来累计报告的新蝙蝠狂犬病毒案例表明，作为对抗原检测的补充，采用通用扩增引物对狂犬病进行RT－PCR诊断是非常方便的。

现在还没有该新病毒感染人类的报告。然而，因为LLEBV和IKOV表现出显著的差异，而且有更多证据表明，当前使用的狂犬病疫苗对遗传谱系I以外的病毒的保护性和交叉中和反应较弱，所以现有疫苗对这些病毒的有效性仍然是一个值得关注的问题。

附图：所有代表性狂犬病毒的系统发生树（基于核蛋白基因前405个核苷酸序列）

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