本人刚开始做腺病毒，有很多东西不明白，请高手帮忙指导一下，细菌内重组的腺病毒基因组，转染293T细胞后，短期内基因组能否在细胞内复制？被转染进重组腺病毒基因组的细胞能否正常分裂产生新的293T细胞？新的293T细胞内是否含有重组腺病毒基因组？大约转染后多长时间有病毒离子产生？产生病毒离子的293T细胞能否正常分裂产生新的293T细胞？病毒离子能否从细胞内释放从而感染其他293T细胞还是通过与相邻细胞和细胞之间的接触感染？

我不是做腺病毒的，但是对于腺病毒载体的研究有所了解。对于楼主提出的问题，我根据自己所知道的提出以下几点建议，仅供参考：
1、首先，这是一个关于腺病毒载体应用方面的问题。所以，希望楼主能够多阅读相关的文献资料和综述，尽快掌握这方面的专业知识与术语。因为你的课题需要用到的腺病毒包装系统与腺病毒载体密切相关。
2、楼主的课题可能会涉及到重组腺病毒的构建、包装、扩增、纯化、病毒滴度测定及重组载体的免疫学或者基因治疗方面的研究等，能够做到哪一步，关键看时间和导师的安排。
3、根据楼主的描述可知，重组腺病毒质粒的构建已经完成，但是，我们还是会关心一个问题：你是否做过鉴定，验证重组腺病毒的构建是成功的。一般而言，做个酶切和测序就可以。

完成以上工作后，就要进行重组腺病毒的包装了，楼主很善于思考，所以提出了上面的一大串问题，对于这些问题，我有以下观点：
1、一般而言，重组病毒载体可以分为复制型和非复制型（也称为复制缺陷型）两种，对于腺病毒载体而言，用于基因治疗的常用复制型的，而用于疫苗研究用的则常用复制缺陷型。考虑到安全等问题，现在一般用复制缺陷型的。复制缺陷型的腺病毒载体（如楼主已经构建成功的重组腺病毒质粒）在能提供反式作用元件的合适的宿主细胞（如293，293T细胞等可以提供腺病毒复制必须的E1 基因）内进行包装，形成只具有一次感染能力的腺病毒。按照转染说明书上写的时间（有的是1-2天，有的是3-5天等，跟你重组的目的基因及转染方法等有关）可以在光镜下观察到空斑形成，细胞变圆、肿胀、脱壁、细胞核变大等细胞病变 。需要指出来的是，如果你的重组腺病毒载体是含有SV40复制起始位点和启动子的话，该质粒在正常293T细胞中是可以进行扩增的；但是包装出来的腺病毒是仅具有一次感染能力的。
2、腺病毒感染细胞后，子代病毒病毒一般会释放到细胞外，所以，但CPE达到90%左右时，可以收集细胞上清，然后再进行新一轮的感染和扩增。但是具体情况可能会因个人的操作的方法、环境温度、收获时机不同而异，因此，最好要有预实验，最初实验的时候，最好把细胞上清和细胞沉淀都收集了做个检测，看看病毒的分布情况，再确定以后实验是收集上清还是沉淀。
3、重组腺病毒的鉴定问题：你可以利用腺病毒载体上的报告基因（如绿色荧光蛋白GFP等），使用荧光显微镜观察是否有蛋白表达，观察细胞是否逐渐出现生长停止和空斑形成等； 此外，还可以提取病毒基因组，通过RT-PCR、Western  blot等方法证明你的目的蛋白是否有表达等。
以后的工作就是重组腺病毒的大量扩增、纯化、滴定和应用上的初步研究了。在所有的实验过程中，始终需要强调的是：一定要做好阴性对照和阳性对照。

最后给大家提个醒：任何人进入实验室前一定要问自己三个问题：要做什么？为什么要做？怎样做？只有解决了这三个问题，接下来的实验活动才会进行得更顺利，完成得更出色！

[ 本帖最后由 lucky 于 2008-8-16 20:38 编辑 ]

首先非常感谢楼上的回答,另外还有一点不明白,我用的是pShuttle-CMV穿梭载体,上面有SV40 pA,不知道你说的SV40复制起始位点是不是指SV40 pA,我觉得好象不是吧,如果不是,是不是就一定不能在293T细胞内扩增,另外包装出来的腺病毒是仅具有一次感染能力是什么意思?期待着你的回答,谢谢!!!!

腺病毒感染细胞后释放的子代病毒是先到上清里,再去感染健康细胞,还是不释放直接感染临近的健康细胞,因为PRSS病毒感染蔓延是通过相邻细胞和细胞之间的接触感染，Marc 145细胞对自由病毒不敏感，并出现了感染细胞群.我不明白腺病毒具体是什么样的

1、据楼主描述，使用的应该是AdEasy腺病毒包装系统。pShuttle-CMV表示该穿梭质粒使用的CMV启动子，是真核表达一个调控元件，在大多数体外转染实验中CMV启动子的效率较SV40更强，由于包装成功的腺病毒的最终不是仅应用于293T细胞中，而是在于提高目的基因在组织细胞中的表达量，因此，更偏向于使用CMV启动子；而质粒上的SV40 pA实际上是SV40 polyA的缩写，表示的是一个SV40的polyA加尾信号，目的在于增强RNA的稳定性，提高蛋白的表达量，而不是用于质粒的扩增。
2、所谓的包装出来的腺病毒只具有一次感染能力，其实是针对宿主细胞而言的。简单的说，因为重组获得的腺病毒是复制缺陷的，所以只能在其包装细胞中才能完成病毒的复制，如果换成其他的细胞，只能引起一过性感染而没有病毒扩增这一说法。
3、正常情况下，腺病毒感染细胞后新形成的病毒粒子是先释放到细胞外再感染新的细胞，而不是直接的从一个感染细胞转移到相邻细胞。
由于本人并非专攻腺病毒，所以见解难免有误差或不全面，以上见解仅供参考。