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发表于 2015-1-31 20:04:10
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九、后续工作) N) n6 V3 w3 ^0 {5 R+ C9 c* A
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克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中,可能会有数个甚至更多的克隆,可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞;所需要的抗体(特异性抗体)分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开,就需要克隆化。克隆化的原则是,对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化,否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制,因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快,二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆,以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失,从而丧失产生抗体的能力。3 z6 Q- U; |* o, X2 n0 `
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(一) 克隆化方案
6 H# m a! n& y9 e+ K) j 用克隆化的方法很多,而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。
7 w& q( ]- u* b4 d; S 1. 有限稀释法的程序% ?" l t, {2 R/ Z7 n
① 制备饲养细胞悬液(同融合前准备)
, r& H3 z! `" k ② 阳性孔细胞的计数,并调细胞数在1~5×103/ml+ T. \, C' F$ X- _" P4 }
③ 取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液,即20个细胞/ml,100μl/孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个/ml,100μl/孔加D、E、F三排,为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml 含饲养细胞的完全培养液,细胞数5个/ml,100μl/孔,加G、H两排,为每孔0.5个细胞。
8 z) K4 l1 p- E3 @6 a2 i ④ 培养4~5天后,在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆,补加完全培养液200μl/孔。" q* g% q4 z) I7 [
⑤ 第8~9天时,肉眼可见细胞克隆,及时进行抗体检测。
: T9 L" q! k9 L) M ?( j' y 注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。
4 j# H! A* g! O! m 2. 软琼脂法
) `1 n, l% a" f" s ① 软琼脂的配制5 g8 ]' N9 i: n! W$ R
含20%FCS(小牛血清)的2倍浓缩的RPMI1640" f5 k: J# z0 O: z" j
1%琼脂水溶液:高压灭菌,42℃预热。2 H5 R. s- E* w) v8 {- ]
0.5%琼脂:由1份1%琼脂加1份含20%小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。5 l7 N; j: T4 j) e* ]5 K
② 用上述0.5%琼脂液(含有饲养细胞)15ml倾注于直径为9cm的平皿中,在室温中待凝固后作为基底层备用。) [0 R2 U2 G. v* I' Z
③ 按100/ml,500/ml或5000/ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。
7 n7 v6 A; Y% q, H7 d7 {; ~; r ④ 1ml 0.5%琼脂液(42℃预热)在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。% V1 Z( T3 w+ ?: p) s# b! v" |
⑤ 混匀后立即倾注于琼脂基底层上,在室温中10分钟,使其凝固,孵育于37℃,5%CO2孵箱中。
' Y3 k T( _5 C6 v$ F& f( u ⑥ 4~5天后即可见针尖大小白色克隆,7~10天后,直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养。
2 Y1 i8 X8 }- e/ ~8 k% W ⑦ 检测抗体,扩大培养,必要时再克隆化。9 }6 z% F# k5 f4 F6 h
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(二) 杂交瘤细胞的冻存
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( S4 [/ T4 Q: T( s- w0 f7 O$ s 及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候,细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存,则因为上述的意外而全功尽弃。
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8 o% f- H, m! M! D5 @4 X& | 杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样,原则上细胞应在每个冻存管中含1×106以上,但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变,在24孔培养板中培养,当长满孔底时,一孔就可以冻一管。
0 I9 Q8 O* _. x/ p! i 细胞冻存液:
( ~2 M$ m+ U8 A5 P. B) T3 A 50%小牛血清9 @$ a" q4 w9 v6 a# K
40%不完全培养液! [) I; M# g, b) X6 X9 b
10% DMSO(二甲亚砜)4 W1 F: [+ M! ~9 d D h* {
冻存液最好预冷,操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降到0℃,再降温时一般按每分钟降温2~3℃,待降至-70℃可放入液氮中。或细胞管降至0℃ 后放-70℃超低温冰箱,次日转入液氮中。也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏,检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性,在液氮中细胞可保存数年或更长时间。 |
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