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发表于 2015-1-31 20:04:10
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九、后续工作4 s& S- y/ `2 Q+ U# E+ H2 l! t; a/ y
* a0 [1 K* F% s5 N3 q
克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中,可能会有数个甚至更多的克隆,可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞;所需要的抗体(特异性抗体)分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开,就需要克隆化。克隆化的原则是,对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化,否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制,因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快,二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆,以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失,从而丧失产生抗体的能力。7 Y( d6 l8 q. r1 F' e
/ h, C* B% Y# F2 r1 G- h
(一) 克隆化方案8 D; q& S8 B2 q' \( i6 g
用克隆化的方法很多,而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。7 R( x8 K* g8 F9 `5 E8 m
1. 有限稀释法的程序
* C1 v, |2 i7 B ① 制备饲养细胞悬液(同融合前准备)
- m& A! Y y0 C2 H: o2 M ② 阳性孔细胞的计数,并调细胞数在1~5×103/ml
5 J1 `( v! J% D2 l ③ 取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液,即20个细胞/ml,100μl/孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个/ml,100μl/孔加D、E、F三排,为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml 含饲养细胞的完全培养液,细胞数5个/ml,100μl/孔,加G、H两排,为每孔0.5个细胞。- }& r1 J+ F1 Q% a$ K# G. q
④ 培养4~5天后,在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆,补加完全培养液200μl/孔。& p2 @0 x$ z- \2 c
⑤ 第8~9天时,肉眼可见细胞克隆,及时进行抗体检测。7 S! M& X. k6 t
注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。% X/ y) R% u7 r5 y6 {
2. 软琼脂法5 N! S8 K, Q/ u; Q/ k+ s
① 软琼脂的配制$ {" r7 {- t, i2 G$ E, Y1 q7 j7 T
含20%FCS(小牛血清)的2倍浓缩的RPMI1640
+ |4 B7 H) J( i9 C+ S8 P# X# q _# s 1%琼脂水溶液:高压灭菌,42℃预热。
9 l7 \) ]- e& j; { 0.5%琼脂:由1份1%琼脂加1份含20%小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。
X- t) O$ x+ L0 N/ t ② 用上述0.5%琼脂液(含有饲养细胞)15ml倾注于直径为9cm的平皿中,在室温中待凝固后作为基底层备用。
+ j' r9 G; q f& {% z2 B c7 L ③ 按100/ml,500/ml或5000/ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。' {1 i6 c- D+ j3 g
④ 1ml 0.5%琼脂液(42℃预热)在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。0 K+ j1 a% r, r6 L: o& C$ ]2 n
⑤ 混匀后立即倾注于琼脂基底层上,在室温中10分钟,使其凝固,孵育于37℃,5%CO2孵箱中。
2 b7 i0 s$ L, D- f, f5 c( [ ⑥ 4~5天后即可见针尖大小白色克隆,7~10天后,直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养。
# k0 Y3 H1 B. n+ K9 g ⑦ 检测抗体,扩大培养,必要时再克隆化。
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) u/ Y5 W1 e+ `; ~- v4 V (二) 杂交瘤细胞的冻存3 V/ K6 G# T; B1 V2 p! x
0 r7 D. `" m, j! b. u8 M
及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候,细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存,则因为上述的意外而全功尽弃。
, K) D. b0 |! i% i1 T# K3 g
* N4 ^9 |* H" Z: \; q 杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样,原则上细胞应在每个冻存管中含1×106以上,但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变,在24孔培养板中培养,当长满孔底时,一孔就可以冻一管。
8 F! x! m: R0 b: [: E) u8 _1 C 细胞冻存液:
/ s1 t$ t9 K1 k3 ^ Z( A, [ 50%小牛血清, C, M# }* d4 Y/ L9 y$ D: V/ `
40%不完全培养液2 w3 J/ t$ m1 e. q+ j
10% DMSO(二甲亚砜)* |5 U5 {/ i0 T7 N6 n
冻存液最好预冷,操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降到0℃,再降温时一般按每分钟降温2~3℃,待降至-70℃可放入液氮中。或细胞管降至0℃ 后放-70℃超低温冰箱,次日转入液氮中。也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏,检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性,在液氮中细胞可保存数年或更长时间。 |
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