中和试验的操作步骤

endosome

1、 在细胞板的边缘按上图6-3所示标记好；

       2、 在A～D行的第1～9列中分别加入50μl对应的抗血清；

       3、 在第10列A～D行中加入50μl的维持液，作为病毒对照孔；

       4、 在第12列A～D行中加入100μl的维持液，作为细胞对照；

       5、 准备10-2和10-3稀释度的样本（最好在实验前测定病毒的滴度，将滴度调至实验所需病毒量，大约为100TID50/50μl）；

       6、 在第1～10列的A行与B行中分别加入50μl的样本1#的10-2和10-3的稀释液，C行和D行中分别加入50μl的样本2#的10-2和10-3的稀释液；

       7、在做病毒回滴的E～H行的1～12列首先每孔加入维持液50μl；

       8、在第1～12列的E～F行作样本1#的病毒回滴,在G～H行作样本2#的病毒回滴；

       9、病毒回滴的稀释度分别为10-2～10-7 ，即每个稀释度做4孔，如1﹟样本的病毒回滴时，将1﹟样本的10-2稀释液加入E行与F行的1、2列，将1﹟样本的10-3稀释液加入E行与F行的3、4列，依次类推。加样时从高稀释度开始，每孔加50μl的样本稀释液。

       10、 盖好盖子，在36℃孵育1h；

       11、在孵育期间，用胰酶消化RD细胞，并准备细胞悬液，浓度大约为1.5×105 /ml个细胞，每块细胞扳至少需要10ml；

       12、加入100μl细胞悬液到所有的孔中；

       13、用无毒性的密封条密封板，在36℃孵育；

       14、使用倒置显微镜每天观察并记录有无CPE的产生；

       15、在病毒对照孔出现100% CPE的时候，继续观察并记录24h；

       16、 按照试剂盒中的说明书，根据被抗血清所中和的无法产生CPE孔的出现情况，来鉴定肠道病毒的型别；

       （三）结果判断

       肠道病毒血清定型的结果见表6-2-3。中和试验的结果是根据排列组合中所含有的肠道病毒型别而定。若8组中只有A组不出现病变，则为埃可病毒15型，因为8个血清组中，只有A组是特有的。又如A,C,F三组能出现中和，则为埃可病毒29型，因为这三组中都含有埃可病毒29型抗血清。在缺少病毒分离的情况下，也常采用血清学诊断，检测患者急性期与恢复期双份血清中对某一肠道病毒的中和抗体是否有显著增高，此时才有诊断意义。但由于肠道病毒型别多，加上某些型之间常出现低滴度的交叉反应。所以只有在无法进行病毒分离时才采用中和方法。

       目前，广谱和血清特异单克隆抗体已研制成功，并应用于组织培养物的荧光检测。这些单克隆抗体的单独应用或混合使用对血清鉴定均起到重要作用。

序道

觉得好复杂啊