口蹄疫病毒接毒过程中参数的影响

序道

口蹄疫病毒接毒过程中参数的影响

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的动物疫病。该病可通过多种途径传播，且难以引起动物的免疫应答。据统计，口蹄疫可感染的动物多达70余种，包括猪、牛、羊等主要畜种。发病动物的主要症状是精神沉郁、流涎、跋行等，与此同时口腔、蹄部和乳房等无毛部位发生水疱，水疱破损后形成溃疡或斑痂。口蹄疫潜伏期通常较短，发病迅速，死亡率很高。不同种类和年龄段的动物呈现不同的死亡率。成年家畜患病时死亡率通常为5%～20%，幼年家畜患病时死亡率为50%～80%，严重时甚至高达100%。由于口蹄疫可造成巨大的经济损失和社会影响，世界动物卫生组织(OIE)将口蹄疫认定为最具危险性的动物疫病，中国政府也认定口蹄疫为一类动物传染病中破坏性最强的疫病。

利用动物细胞培养法生产疫苗过程中的非常重要的一个步骤就是利用病毒感染宿主细胞，并利用宿主细胞扩增产生更多的病毒粒子。接毒过程中比较重要的几个参数分别为病毒感染复数MOI ( Multiplicity of Infection ) , 病毒感染时间TOI ( Time of infection )、收毒时间、细胞的初始接种密度以及接毒时培养体系中的营养条件等。

MOI是指在接毒时病毒粒子的个数与体系中细胞个数之比。提高MOI尽管能增加病毒贴附于宿主细胞的几率，但这种病毒扩增优势仅仅体现在前期。当病毒连续扩增时，细胞内错配病毒的比例将大幅提升，严重影响最终疫苗产量和质量。同时，增大MOI意味着接毒时需准备毒种量的增大。采用较低的MOI能减少接毒过程中病毒种子液的用量，但若MOI过低则将延长病毒的复制周期，使细胞提早凋亡。

TOI是指细胞培养中接入病毒的时间。一般接毒时间设定在细胞对数生长期。细胞对数生长期的时间跨度较长，将其可细分为对数生长初期、中期和后期。不同时间接种病毒将影响培养液中的病毒滴度，通常最适宜的接毒时间为对数生长初期。此时接毒，则在对数生长中期时，病毒己吸附于细胞表面。这时细胞代谢活跃，有利于病毒的扩增。

细胞接种浓度也是病毒生产中需要关注的因素。初始接种密度将影响延滞期的长度及接毒时培养体系中营养成分的含量。较低的初始接种浓度将延长细胞生长周期，接毒时细胞浓度也相对较低，不利于病毒扩增。但若接种密度过高，一方面细胞将迅速大量死亡，不利于病毒扩增，另一方面培养体系中的营养物质也将被迅速消耗。因此，确定既可获得较高细胞密度又能实现病毒大量扩增的初始细胞浓度对于疫苗的工业化生产具有重要的意义。

接毒时培养液中的营养环境直接影响病毒增殖的产量和质量。若培养基营养过于丰富，则产生的代谢产物过多，将影响细胞正常生长。若培养基中营养不够充足，则前期生长阶段细胞消耗大量培养基中关键的营养成分，影响后期病毒的生产。因此如何保证后期病毒生产中的营养充足是病毒生产中亟需解决的问题。通常采取的措施是接毒时先采用离心的方式将细胞所处的营养环境更换为新鲜培养基，然后按照特定的条件接入病毒。

口蹄疫病毒具有高度传染性，一旦处理不当将引起口蹄疫的暴发。基于此，该病毒的研究和使用受到国家相关部门的严格限制，因此，口蹄疫病毒接毒条件的优化案例较少。然而，许多科研机构和企业通过优化其他病毒接毒过程中的参数实现了疫苗生产过程的优化和产量的提高。例如樊庆帅等通过分别设置5个MOI梯度(0.01, 0.1, 0.5, 1和5)和4个TOI梯度(24, 48, 72和96h)分别考察了MOI和TOI对接入病毒时细胞感染率、病毒滴度及细胞密度的影响，最终确定MOI为0.5和TOI为72h时可获得最高病毒滴度，并建立了适合狂犬病灭活疫苗生产的工艺流程。2015年，孔文刚等通过考察微载体浓度和换液操作对MDCK细胞生长和流感病毒生产的影响，发现换液操作使得两种微载体浓度下细胞的最大活细胞密度较批培养分别提高了23%和185%；此外，孔文刚还发现换液操作能够有效缓解高细胞密度下单细胞产毒率下降，进一步提高了流感疫苗的生产能力。

与此不同的是，2010年贾英在研究口蹄疫病毒培养中细胞密度和病毒滴度间关系时，发现细胞密度的改变并未引起病毒LgLD50规律性的变化。由此，作者推断病毒效价和细胞培养密度无必然关系。这也提醒科研工作者在灭活疫苗工艺开发的过程中应更加注重针对性，一味增大细胞的接种密度并不一定都能实现增加病毒产量的目的。2008年石慧颖等观察MOI对脊髓灰质炎病毒增殖影响时发现当病毒MOI从0.001增加至0.1时，相同时间细胞病变率提高，但三种MOI条件下细胞接种至脱落全程短于72h 。MOI的大小与细胞病变发生时间的长短几乎没有关系，三种MOI条件下细胞72h内均可发生病变，故低MOI即可满足疫苗生产的需要，并使病毒滴度提高。 2010年，刘旭平等设置5个MOI梯度(0.1，1，5，30，100)考察两种培养体系(方瓶、转瓶)下不同MOI对腺病毒在细胞中扩增的影响。结果显示随着MOI增加，细胞生长受到的抑制逐渐增强，细胞的死亡速率也逐渐增大。同时在病毒复制方面，MOI由0.1增加至5时，随着感染复数增加单细胞产毒量逐渐增加，而当MOI继续增加时，由于细胞过早裂解单细胞产毒量逐渐降低。由此判断，MOI为5是最优的参数。鉴于以上各机构研究人员的成功经验，开发适于特定口蹄疫病毒的接毒工艺将成为提高产品质量，优化资源配置的重要途径。

研发部 刘萍编审 李永霞

内毒素的检测和去除

摘要：内毒素是一类毒性很强的大分子物质，它的含量关系着疫苗的安全性。因此，在疫苗生产中，检测与控制内毒素十分重要。本文主要阐述疫苗生产中内毒素产生的原因，检测及去除方法。

关键词：内毒素，口蹄疫，疫苗

1 内毒素及其来源

1.1 内毒素

内毒素（endotoxin）是存在于革兰氏阴性菌细胞壁外膜表面的一种大分子物质，一般只有在细胞死亡或分解时自行释放到周围介质中，特殊条件下也可以从活细胞中直接泄漏出来。内毒素又被称为热原，是一种脂多糖物质，具有耐热性，不易被去除。若疫苗中存在一定浓度的内毒素，接种动物后，可引起动物发热，休克等，严重时甚至造成死亡。

1.2 内毒素的来源

因为革兰氏阴性菌无处不在，所以内毒素几乎存在于任何地方。在疫苗生产中一定要重视和尽可能减少内毒素的污染。

生产用水中内毒素的含量是导致疫苗安全性的关键因素之一。大量研究表明，疫苗生产过程中内毒素主要来源于培养液和配制用水，其在贮存过程中易受到革兰氏阴性菌的污染。贮水罐，纯水系统的过滤器和连接管道，以及培养液容器等都可能受到革兰氏阴性菌的污染。

工作人员进出车间携带的物品，以及空气净化系统久不维护，都有可能造成生产车间内的空气尘埃浓度升高，导致内毒素污染。

生产用具、管道、泵、阀门、滤器等的清洗消毒不彻底也会造成内毒素污染。生产原料的污染，如血液制品，细胞培养基。人为操作不规范也会引起内毒素污染。

2 内毒素的检测

目前，内毒素的检测方法较多，但是各存在利弊，因此，选取检测方法要根据实际需求，不建议采取单一的检测方法。

2.1 鲎试验法

鲎试验法是通过酶的级联反应而实现，内毒素在二价阳离子的参与下激活C因子（FC），然后激活其它酶原，产生一系列凝集酶反应。该方法是目前检测内毒素最特异和最灵敏的方法。

2.2 重组C因子法

重组C因子法是使用一个单一的蛋白（重组C因子）作为有效活性成分。反应中内毒素激活重组C因子，活化的重组C因子将荧光底物裂解，产生荧光复合物，定量检测荧光复合物来量化内毒素。这种方法可有效避免假阳性的产生。该方法可用于药品生产，环境，器械生产中的内毒素检测。

2.3 热原试验法

该方法是比较广泛的检测热原的方法，利用微量内毒素可引起动物体温升高的特性来测试其含量。这种方法存在灵敏度低，无法定量测定，种属差异大，周期长等问题。

2.4 其它方法

除了上述较常见的方法外，还有一些方法也被应用于内毒素的检测，如免疫学方法（酶联免疫吸附检测法，火箭免疫电泳鲎试验法，双抗体夹心ELISA法等），生物学方法，化学发光法，流式细胞法，高效液相色谱法等。

3 内毒素的去除

一直以来，去除内毒素都是疫苗生产中的一个难题。其热稳定性高，对PH值不敏感。目前，已有一些去除内毒素的方法，但其去除方法还有待进一步研究。

3.1 超滤法

利用内毒素与其他物质的分子量的差别来去除内毒素。一般在样品流经超滤膜时，超滤膜将内毒素截留在膜上，而让其它低分子量物质透过，从而有效控制内毒素的含量。超滤膜的内毒素去除率较高，变化范围较宽，高达98.7%，低至53.3%。因热原是一类形态和相对分子质量均不确定的物质，其种类，浓度也会有所不同，因此内毒素的去除率也是由多种因素所决定，如超滤运行的压力，超滤浓缩的倍数，超滤洗脱的体积等。由于内毒素聚合体可能会在高温或酸性环境中分解，进而造成内毒素分子的真正毒性部分类脂A穿过滤膜而进入滤液中。该方法去除内毒素，抗原损失较少，并且富集样品，能够满足疫苗生产的要求。

3.2 活性炭法

该方法主要适用于水等组分简单的小分子溶液的内毒素去除。因其选择性能差，易吸附有效成分，一般较少用。该方法可与超滤法联合使用去除内毒素的效果较佳。

3.3 热处理法

该方法主要用于耐热物品内毒素的去除。

3.4 化学降解法

使用强酸，强碱或氧化剂使内毒素自身降解，从而去除内毒素。

3.5 亲和膜分离系统法

此法基于亲和色谱法，以纤维素膜等做基础材料，通过化学的方法键合不同的配基，这些配基对内毒素分子或聚集体有较强的吸附作用。此法吸附特异，吸附量大，去除率高，膜可再生，且具备一定的耐酸耐碱性。

3.6 其它方法

吸附技术和双向萃取法也用于去除内毒素，但这两类方法涉及的试剂，步骤较多，易造成污染，使用较少。

生产部 杨锐 编审 李永霞

（来源于中农威特生物科技股份有限公司-搜狐文章）