[转移贴]想向各位前辈请教一下关于PCR产物纯化与测序问题

cao1976

原贴由minister发表于 2009-8-29 10:20
http://biosky.haotui.com/thread-11511-1-7.html

想向各位前辈请教一下关于PCR产物纯化与测序问题。

我看到了有两个方案：

1.PCR扩增产物经过电泳，割胶后使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行DNA回收纯化，送至华大基因测序。

2.扩增产物回收纯化后与PMD-18T载体连接，筛选阳性克隆，经过双酶切鉴定后进行序列测定。

我的PCR产物就单一的一条带，大约500bp吧，先用的是方案1，华大测序结果正常，但是我想问一下为什么很多人发PAPER都写方案2啊？

为什么呢？:~)有什么好处呢？

cao1976

jbclinnic 发表于 2009-8-29 11:39 ：
扩增片段一样，但是很可能存在变异
比如，很多病毒是混合侵染，得到的PCR产物就是多态性混合的产物
直接回收不能避免此类情况。

cao1976

wjg_1979 发表于 2009-8-29 12:13 ：

两种方案：一种是用克隆载体的，另一种是不用克隆载体的．两种有什么区别呢？
区别在于不用载体的是直接用ＰＣＲ产物测序，这种是用ＰＣＲ扩增引物来测序，通常这样的测序结果前100 nt是不准确的或是不可靠的，同时，这样还会另一个问题就是测不出结果，因为测序引物的要求较ＰＣＲ扩增引物要高些．除非是你要的序列不包括前100-150nt序列，否则，不建议直接用ＰＣＲ产物测序．而连接上载体后可克服这些问题．另外，克隆质粒易于保存，以便以后用得着，而ＰＣＲ产物保存较易降解．结上所述，Paper中都是用作者所说的第二种方案．

cao1976

123qsz321发表于 2009-8-30 11:12 ：
PMD-18T载体连接以后 这种带有目的片段的质粒可以保存 并且可以为后续试验提供保障 例如 你要做目的片段的蛋白表达 前期的工作就是验证你的片段得到测序结果 确保没有突变  为下一步表达载体的构建提供保障 因为PMD-18T载体是比较便宜  购买的较好的表达载体是有点贵 所以需要前期的验证和保障试验的顺利  说的有点啰嗦 本人陋见

cao1976

stare024 发表于 2009-8-30 12:36 ：
同意楼上。克隆到载体上便于以后的实验操作。
克隆到质粒上便于保存，以后想再用这个片段的话，直接扩增质粒用质粒上的酶切位点切下即可。
对于一些酶切位点少的片段，也可以在后续的实验中采用质粒上不同的酶切位点切得所要的片段，连接不同的载体。