慢病毒培养纯化的几个问题

晚风hit

第一次做慢病毒，很头痛，向大家请教几个问题。 1. 我做的是和别的实验室合作课题，是做RNA干扰，他们提供了质粒，但我不知道名称，一共四个质粒，我猜测可能是invitrogen 的BLOCK-iT，我3个包装质粒和载体质粒质量比是1:1:1:2，请问这样对吗？ 2. 我在转染293细胞后发现荧光很多，几乎100%，这是不是代表产出的病毒也会很高？ 3. 第3天开始收集上清，上清是不是可以直接用来感染细胞，而不用浓缩？ 4. 因为浓缩后的病毒最后还是要稀释，一般稀释100-10000倍，那直接用上清是不是更好。 5. 感染新的293细胞后接连3天都没见到一个荧光细胞，第四天才发现几个针尖大的光点，是我的病毒滴度低还是活力不够，还是转染问题。 6. 包装出来的慢病毒是不是包含gag、pol 、env三种蛋白外，还包括GFP蛋白和RNA？我发现虽然我感染的细胞没有发荧光，但其背景偏绿，而没有感染的细胞，其背景是黑色的？

1.如果你用的是invitrogen的KKIT,四个质粒的最佳的质量比你可以参考他们的说明书。 2.质粒是带有GFP的，转染细胞后当然也会表达产生荧光蛋白，所以转染细胞后产生的荧光并不代表产生重组病毒会很高。 3.至于细胞上清中病毒的效价有多高，你需要进行效价的测定。 4.如果你的后续实验对重组病毒的效价没有特殊的要求，细胞上清一般不需要浓缩，因为浓缩也会损失一部分病毒。

质粒只是含eGFP基因了 不会发光的 1. 我做的是和别的实验室合作课题，是做RNA干扰，他们提供了质粒，但我不知道名称，一共四个质粒，我猜测可能是invitrogen 的BLOCK-iT，我3个包装质粒和载体质粒质量比是1:1:1:2，请问这样对吗？ 问题不大，请自行优化 2. 我在转染293细胞后发现荧光很多，几乎100%，这是不是代表产出的病毒也会很高？ 只是说明转然效率，在相同条件下 转染效率越高包装率越好 3. 第3天开始收集上清，上清是不是可以直接用来感染细胞，而不用浓缩？ 晚了 最好48小时收集吧 不用浓缩 4. 因为浓缩后的病毒最后还是要稀释，一般稀释100-10000倍，那直接用上清是不是更好。 看情况 不好说 5. 感染新的293细胞后接连3天都没见到一个荧光细胞，第四天才发现几个针尖大的光点，是我的病毒滴度低还是活力不够，还是转染问题。 应该是包装的问题 6. 包装出来的慢病毒是不是包含gag、pol 、env三种蛋白外，还包括GFP蛋白和RNA？我发现虽然我感染的细胞没有发荧光，但其背景偏绿，而没有感染的细胞，其背景是黑色的？ 不含eGFP蛋白 只是含有eGFP基因的RNA罢了

正在做慢病毒，也遇到同样的问题，自己一点看法如下，大家共同交流指正。 1. 我做的是和别的实验室合作课题，是做RNA干扰，他们提供了质粒，但我不知道名称，一共四个质粒，我猜测可能是invitrogen 的BLOCK-iT，我3个包装质粒和载体质粒质量比是1:1:1:2，请问这样对吗？ 很头疼这个问题，我查过invitrogen的manual，其中用的质粒mix没有给出过比例。现在不少资料是说按照摩尔比比较好，但是因为质粒大小不一样，估计进入细胞的难易程度不一，对转染效率应该会有影响。目前是在摩尔比的基础上调整，还没得到满意效果。 2. 我在转染293细胞后发现荧光很多，几乎100%，这是不是代表产出的病毒也会很高？ 个人认为荧光只代表一个含GFP的质粒的转染效率，而病毒的产生需要4个质粒同时存在。所以荧光比例高不一定病毒就会多。当然，每个质粒的比例都高自然病毒产生就多。 3. 第3天开始收集上清，上清是不是可以直接用来感染细胞，而不用浓缩？ 48～72h收毒会好些，浓缩不浓缩是看你需要的滴度。我们一般没有浓缩。浓缩还有一个问题是会把包装细胞培养基中的代谢产物浓缩，可能会对细胞有毒性。如果用蔗糖梯度可能会好些，但自己没试过 4. 因为浓缩后的病毒最后还是要稀释，一般稀释100-10000倍，那直接用上清是不是更好。 见3 5. 感染新的293细胞后接连3天都没见到一个荧光细胞，第四天才发现几个针尖大的光点，是我的病毒滴度低还是活力不够，还是转染问题。 光点是不是细胞这点应该容易判断吧，光镜荧光配合看看就是。滴度低可能是问题。 6. 包装出来的慢病毒是不是包含gag、pol 、env三种蛋白外，还包括GFP蛋白和RNA？我发现虽然我感染的细胞没有发荧光，但其背景偏绿，而没有感染的细胞，其背景是黑色的？ 最后的慢病毒应该是含有GFP的核酸序列，但我们用的新鲜病毒液里面肯定是有荧光蛋白，所以你感染的细胞背景偏绿，可以换用新鲜无病毒培养基后再看看，背景应该就没有颜色啦

1：我用的是第二代慢病毒，对于10cm培养皿，转染细胞时质粒总量是25ug，其中，包膜质粒2.5-4.5ug，包装质粒8-10ug，载体质粒10-12ug 2：一般情况下会很高 3：第三天就太晚了，我用的是磷酸钙法转染，转染12h后换页，换液后24h、48h各收集一次上清。太晚收集的话，培养基里的营养物质已被耗尽，PH值等都不再适合293T细胞生长，会影响产毒效率。tronolab实验室现在都是间隔8-12h就收集一次上清。这时的上清的293T转染滴度滴度大概10E6，可以直接使用 4：直接用上清效果更好，因为上清中含有一些对病毒起保护作用的蛋白，使得病毒更加稳定。 5：都有可能有问题，还和细胞生长状态有很大的关系 6：包装细胞系表达的GFP不会分泌到细胞外，没有env

Anny