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慢病毒培养纯化的几个问题

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楼主
发表于 2015-3-27 15:57:08 | 只看该作者 回帖奖励 |倒序浏览 |阅读模式
第一次做慢病毒,很头痛,向大家请教几个问题。
1. 我做的是和别的实验室合作课题,是做RNA干扰,他们提供了质粒,但我不知道名称,一共四个质粒,我猜测可能是invitrogen 的BLOCK-iT,我3个包装质粒和载体质粒质量比是1:1:1:2,请问这样对吗?
2. 我在转染293细胞后发现荧光很多,几乎100%,这是不是代表产出的病毒也会很高?
3. 第3天开始收集上清,上清是不是可以直接用来感染细胞,而不用浓缩?
4. 因为浓缩后的病毒最后还是要稀释,一般稀释100-10000倍,那直接用上清是不是更好。
5. 感染新的293细胞后接连3天都没见到一个荧光细胞,第四天才发现几个针尖大的光点,是我的病毒滴度低还是活力不够,还是转染问题。
6. 包装出来的慢病毒是不是包含gag、pol 、env三种蛋白外,还包括GFP蛋白和RNA?我发现虽然我感染的细胞没有发荧光,但其背景偏绿,而没有感染的细胞,其背景是黑色的?


1.如果你用的是invitrogen的KKIT,四个质粒的最佳的质量比你可以参考他们的说明书。
2.质粒是带有GFP的,转染细胞后当然也会表达产生荧光蛋白,所以转染细胞后产生的荧光并不代表产生重组病毒会很高。
3.至于细胞上清中病毒的效价有多高,你需要进行效价的测定。
4.如果你的后续实验对重组病毒的效价没有特殊的要求,细胞上清一般不需要浓缩,因为浓缩也会损失一部分病毒。


质粒只是含eGFP基因了 不会发光的

1. 我做的是和别的实验室合作课题,是做RNA干扰,他们提供了质粒,但我不知道名称,一共四个质粒,我猜测可能是invitrogen 的BLOCK-iT,我3个包装质粒和载体质粒质量比是1:1:1:2,请问这样对吗?
问题不大,请自行优化

2. 我在转染293细胞后发现荧光很多,几乎100%,这是不是代表产出的病毒也会很高?
只是说明转然效率,在相同条件下 转染效率越高包装率越好

3. 第3天开始收集上清,上清是不是可以直接用来感染细胞,而不用浓缩?
晚了 最好48小时收集吧 不用浓缩

4. 因为浓缩后的病毒最后还是要稀释,一般稀释100-10000倍,那直接用上清是不是更好。
看情况 不好说

5. 感染新的293细胞后接连3天都没见到一个荧光细胞,第四天才发现几个针尖大的光点,是我的病毒滴度低还是活力不够,还是转染问题。
应该是包装的问题

6. 包装出来的慢病毒是不是包含gag、pol 、env三种蛋白外,还包括GFP蛋白和RNA?我发现虽然我感染的细胞没有发荧光,但其背景偏绿,而没有感染的细胞,其背景是黑色的?
不含eGFP蛋白 只是含有eGFP基因的RNA罢了


正在做慢病毒,也遇到同样的问题,自己一点看法如下,大家共同交流指正。

1. 我做的是和别的实验室合作课题,是做RNA干扰,他们提供了质粒,但我不知道名称,一共四个质粒,我猜测可能是invitrogen 的BLOCK-iT,我3个包装质粒和载体质粒质量比是1:1:1:2,请问这样对吗?

很头疼这个问题,我查过invitrogen的manual,其中用的质粒mix没有给出过比例。现在不少资料是说按照摩尔比比较好,但是因为质粒大小不一样,估计进入细胞的难易程度不一,对转染效率应该会有影响。目前是在摩尔比的基础上调整,还没得到满意效果。

2. 我在转染293细胞后发现荧光很多,几乎100%,这是不是代表产出的病毒也会很高?

个人认为荧光只代表一个含GFP的质粒的转染效率,而病毒的产生需要4个质粒同时存在。所以荧光比例高不一定病毒就会多。当然,每个质粒的比例都高自然病毒产生就多。

3. 第3天开始收集上清,上清是不是可以直接用来感染细胞,而不用浓缩?

48~72h收毒会好些,浓缩不浓缩是看你需要的滴度。我们一般没有浓缩。浓缩还有一个问题是会把包装细胞培养基中的代谢产物浓缩,可能会对细胞有毒性。如果用蔗糖梯度可能会好些,但自己没试过

4. 因为浓缩后的病毒最后还是要稀释,一般稀释100-10000倍,那直接用上清是不是更好。

见3

5. 感染新的293细胞后接连3天都没见到一个荧光细胞,第四天才发现几个针尖大的光点,是我的病毒滴度低还是活力不够,还是转染问题。

光点是不是细胞这点应该容易判断吧,光镜荧光配合看看就是。滴度低可能是问题。

6. 包装出来的慢病毒是不是包含gag、pol 、env三种蛋白外,还包括GFP蛋白和RNA?我发现虽然我感染的细胞没有发荧光,但其背景偏绿,而没有感染的细胞,其背景是黑色的?

最后的慢病毒应该是含有GFP的核酸序列,但我们用的新鲜病毒液里面肯定是有荧光蛋白,所以你感染的细胞背景偏绿,可以换用新鲜无病毒培养基后再看看,背景应该就没有颜色啦

1:我用的是第二代慢病毒,对于10cm培养皿,转染细胞时质粒总量是25ug,其中,包膜质粒2.5-4.5ug,包装质粒8-10ug,载体质粒10-12ug
2:一般情况下会很高
3:第三天就太晚了,我用的是磷酸钙法转染,转染12h后换页,换液后24h、48h各收集一次上清。太晚收集的话,培养基里的营养物质已被耗尽,PH值等都不再适合293T细胞生长,会影响产毒效率。tronolab实验室现在都是间隔8-12h就收集一次上清。这时的上清的293T转染滴度滴度大概10E6,可以直接使用
4:直接用上清效果更好,因为上清中含有一些对病毒起保护作用的蛋白,使得病毒更加稳定。

5:都有可能有问题,还和细胞生长状态有很大的关系
6:包装细胞系表达的GFP不会分泌到细胞外,没有env

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沙发
发表于 2015-8-17 12:34:48 | 只看该作者
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