【焦点】HPV分型定量检测研究

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背景

　　宫颈癌是女性的第二恶性肿瘤，仅次于乳腺癌，也是目前唯一一个病因明确的恶性肿瘤。据2002年统计，全球每年约有50万新发病例，27万多人直接死于子宫颈癌。而中国均占世界的三分之一，并且发病率和死亡率仍然在逐年上升，明显趋向年轻化。1995年国际癌症研究机构（IARC）正式宣布人乳头状瘤病毒（HPV）某些亚型持续性感染是导致宫颈癌的最主要因素。

　　HPV是一种主要存在于人皮肤、黏膜及女性宫颈上皮细胞异形区的病毒，目前已发现的200余种病毒亚型，为一组形态和基因结构相似但致瘤表现不同的病毒，可引起人类上皮的良性和恶性肿瘤。依据WHO国际癌症研究机构及其他研究成果，把与宫颈癌发生有关的HPV亚型称为高危和中危亚型，致癌性高且最常见的有HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、73、82（其中HPV26，53和66倾向于中度病变）；与肿瘤不相关的称为低危亚型，最常见的为HPV6,11和81等。

　　研究提示70%以上的宫颈癌患者体内均发现感染HPV16或18亚型，而在宫颈癌的发生中HPV16、18等高危亚型的致癌性远远高于其他亚型，美国阴道镜及妇科病理学会将HPV16和18亚型阳性列为病理学检测指症。WHO主导的巴西和丹麦多中心大样本研究提示，病毒载量是除亚型之外导致肿瘤发生发展的另一个关键的独立因素。同时，大量研究也提示除亚型外，HPV的致癌性还与感染者的病毒载量相关，病毒载量被认为是一个潜在的识别CIN2及以上病理等级的生物学指标。对HPV病毒载量监测涉及到感染的细胞数以及每个感染细胞中的病毒数，因此受两个主要因素影响：HPV病毒感染宫颈表面的范围及感染区域的病毒水平。但由于无法控制受检女性宫颈脱落的细胞数获取时的差异，到目前为止很少有研究对这18个高危亚型进行分型同时又进行定量分析。

　　许多研究表明，高的病毒载量已经展现与HPV持续性感染和宫颈恶性病变相关，在指导ASCUS阴道镜的运用方面具有重要的意义，能避免一些过度的侵入性检查。部分研究认为HPV16的病毒载量能预测病毒的持久性，可以评估妇女进展为宫颈癌的风险或者提示一个较为良好的预后。

人乳头瘤病毒核酸检测

　　人乳头瘤病毒至今尚不能在体外培养，因而对其检测主要依赖于分子生物学技术。目前HPV病毒基因组核酸检测常用的方法有DNA芯片杂交法、荧光定量PCR法和杂交捕获法。DNA芯片杂交法是基于传统的反向斑点杂交技术，将扩增产物与固定于支持物上的检测探针进行反应并显色，此类方法能进行HPV病毒的分型检测，但无法明确检测病毒载量，而其PCR过程一般是采用通用引物，因此对于部分亚型来说其灵敏度和特异性不及型特异性引物检测效果；实时荧光定量PCR法则可采用型特异引物探针对HPV分型检测，并提供病毒载量定量的可能，该法将普通PCR的高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性有机结合；杂交捕获技术（HC-Ⅱ）是一种采用免疫技术并通过化学发光使基因信号放大的微孔板检测方法，其缺点是对HPV检测结果难以明确具体的基因型，病毒载量的确定又会受样本中脱落细胞取样量的影响。综上所述，从方法学角度来说，荧光定量PCR法为目前HPV定性及定量检测中最优的技术平台。

　　研究提示不同HPV型别的致癌性和致癌率均有差异，临床上对与宫颈癌相关的高危型亚型间风险等级有一定的评估，如风险等级由强到弱依次如下：HPV16、18、45、31、33等。同时致癌性最强的HPV16与宫颈鳞癌关系最为密切，而HPV18易导致宫颈腺癌。经大量临床随访研究，不同亚型的持续性感染时间也不一样，其中HPV16亚型的持续时间最长，平均为12.4月，其次是HPV31、33、52亚型，持续性研究也提示提示高危型的持续时间9.3月（平均）高于低危型的持续时间8.4月。从流行病学角度来看，通过型别区分可观察到HPV感染型别也存在很大的地域性差异，如在西方发达国家最常见的亚型为HPV16和18，HPV45主要出现在非洲西部地区，而HPV58和52却在中国妇女中检出率较高，仅次于HPV16亚型。

　　其次，HPV持续性感染是宫颈癌发生的必要条件，相同基因型持续性感染时会增加患宫颈癌的风险，因此区别持续性感染和一过性感染非常重要，同一型别持续性感染风险远高于不同型别反复感染，如对丹麦哥本哈根11088名登记在册的妇女进行为期数年的跟踪随访研究，对受检人群进行了宫颈细胞涂片检查，HPV检测和组织病理检查。该研究中假定连续两次HPV检测阴性的危险系数为1.0，各种持续感染情况的危险系数是其与1.0的比值，结果展示：2次检测（持续感染间隔2年）结果为阳性，且感染型别不同时则HSIL的危险系数为192.7，而2次检测感染型别相同（至少一个亚型相同）时则HSIL的危险系数上升为813.0。同时，持续感染高危型HPV相同基因型，尤其是HPV18,应该被认为是CIN2-3复发的高危风险因子性。鉴于前期研究提示大多数妇女HPV感染是瞬时的，在2年之内可自动清除，而HPV高危亚型的型特异性持续感染是高度鳞状上皮内病变或者宫颈癌发生的首要条件，因此在宫颈癌的早期筛查中对HPV型别区分有着重要意义，通过核酸检测可判定病毒感染的有无并能鉴定HPV感染的型别，区分单纯HPV型别感染和多重HPV型别感染，有助于提高诊断HPV持续感染的特异性。

人乳头瘤病毒定量检测的意义

近期，多数研究将病毒载量预测病毒的清除以及疾病的进展作为主要方向，大量的研究提示在宫颈样本中HPV致癌型别的病毒载量测试（包括HPV16亚型）是HPV持续性感染和宫颈鳞状上皮内瘤变发生的风险的一个合适的指示因子。

目前对HPV定量研究的检测方法主要有HC2和荧光定量PCR法。

HC2

　　HC2是目前市面上可以用于进行半定量研究的最常见成品试剂盒，由于在市面上广泛使用，因而有许多关于该试剂盒的HPV定量方面临床意义的研究。但是由于HC2不考虑样本中宫颈脱落细胞数量，无法鉴定HPV型别，也无法区分单重和多重感染，对于载量与宫颈病变等级的研究来说并不精确。而很多研究已经提示HPV病毒载量是宫颈癌的一个型别特异性生物指标，每个亚型病毒载量的临床意义也不尽相同，因此对于病毒载量的检测应建立在型别特异性上。

PCR

　　荧光定量PCR法为目前得到普遍认可的病毒载量检测的金标准，众多研究采用此方法进行HPV病毒载量临床意义的研究。因HPV为胞内病毒，HPV定量准确度一直受限于取样的差异，而通过看家基因可准确定量取样细胞数，获得单位细胞内的病毒载量。因此，病毒载量的表达方式（病毒量与细胞数之间的比值）已经得到广大研究者的认可，其载量分析相对来说更可靠也更具有可重复性——不因医生取样差异而导致错误的病毒载量。尽管很多研究者采用此方法来对HPV进行精确定量研究其临床意义，但是各研究间采用的体系灵敏度及定量衡量的标准并不统一，因而各个研究结论间可以作为参考，但是不具备严格的可比性。因此对于定量的准确性建议采用WHO认可的英国国家生物制品检定所（NIBSC）制备的HPV16和18亚型定量标准品进行统一评估。

综合和总结众多研究结果可以得出定量研究的结论：

（1）HPV病毒载量是宫颈癌的一个型别特异性生物指标，对于病毒载量的研究应建立在型别特异性基础之上；

（2）病毒载量预测HPV感染的持续性，初次检测时病毒载量越高则持续性感染时间越长，宫颈癌发生的危险性也越高。

（3）应用于ASCUS分流，高的病毒载量已经展现与HPV持续性感染和宫颈恶性病变相关，在指导细胞学结果ASCUS后阴道镜的运用方面具有重要的意义，能避免一些过度的侵入性检查，尤其是HPV16的载量分析。

（4）病毒载量的检测可以作为宫颈细胞学异常的指征之一。与此同时，尤其是应该关注细胞学结果正常但是出现高的病毒负荷的妇女。事实上，一些研究已经指出细胞学正常的但是有高的病毒载量也可能是瘤变进程的高危因子。因此，病毒载量的检测能良好地辅助细胞学检测进行宫颈癌的早期筛查。

（5）病毒载量检测可以应用于宫颈癌的基线筛查中，研究提示基线筛查中高的病毒载量可以预测后续病变等级的风险。高病毒载量也被认为可能是协助辨别CIN进程中有高度风险妇女的一个候选指标。

（6）病毒载量监测能良好地应用于病人的随访检测中。比起某一时段单次取样的高病毒载量，HPV在一段时间病毒载量的增加可能更能展现病毒动力学变化更重要，也是HPV感染结果最好的预测因素。随访时结合型特异性病毒载量的检测可以区别瞬时感染还是持续性感染改变，更能预测高级别CIN进程的风险或提示一个较为良好的预后。

　　因而，HPV分型和定量检测对临床有重要的指导意义，宫颈癌的早期筛查及随访，分流等过程中对HPV分型和定量同时检测，即对单个病人定期进行高危型尤其是HPV16亚型病毒载量的检测，观察病毒载量随着时间的推移及治疗措施等的变化，预测宫颈癌的进展或消除。