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[诊断资讯] Science子刊:利用LAMP方法快速低成本地检测寨卡病毒

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发表于 2017-5-8 08:44:53 | 显示全部楼层 |阅读模式
在一项新的研究中,来自美国、巴西、尼加拉瓜和德国的研究人员开发出一种新的技术而使得通过捕捉和测试蚊子来监控寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)传播能够变得更加快速和更加低廉。这种基于环介导等温扩增反应(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)的检测方法能够区分寨卡病毒亚洲毒株和非洲毒株,而且在理论上可能被用来在现场直接检测蚊子中可能存在的寨卡病毒。相关研究结果发表在2017年5月3日的Science Translational Medicine期刊上,论文标题为“Rapid and specific detection of Asian- and African-lineage Zika viruses”。

美国普渡大学的Richard Kuhn(未参与这项研究)说,“你能够仅是捕捉蚊子,将它们磨碎,或者获得被感染者的血液样品和其他类型的样品,随后直接检测寨卡病毒是否存在。你不必进行RNA纯化,你也不必执行逆转录步骤,因而真正地简化这个过程。”

美国斯坦福大学的Desiree LaBeaud(也未参与这项研究)补充道,这种方法能够“在偏远地区开展测试,而且也不需要使用昂贵的设备。它可能用于传病媒介监控和临床诊断。”

尽管在1952年,寨卡病毒首次在非洲在人体中被鉴定出,但是直到近年来一种寨卡病毒亚洲毒株在中美洲和南美洲爆发流行病,科学家们才确定这种病毒与头小畸型相关联。这种亚洲毒株与这种非洲毒株存在显著的序列差异。如今,随着这种亚洲毒株在广泛地扩散,而且可能扩散到这种非洲毒株存在的区域,区分这两者可能变得至为重要。

存在于蚊子或人体中的寨卡病毒通常是在实验室中利用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)进行检测的。不过,论文通信作者、美国科罗拉多州立大学研究员Joel Rovnak说,随着寨卡病毒感染在新的地方出现,利用一种廉价的简易的现场检测方法可更加简单地监控蚊子、进行诊断和鉴定寨卡病毒毒株。

正如聚合酶链式反应(PCR)那样,LAMP利用序列匹配的引物扩增靶DNA序列。但是不同的是,PCR需要让反应试剂混合液不断循环地经历不同的温度,而LAMP是在恒定的63° C下进行的。这意味着无需购买价格在1.5万美元到2万美元的PCR热循环仪,而仅需构建250美元的加热块(heat block)。

寨卡病毒是一种RNA病毒,扩增它的核酸需要先通过逆转录步骤将其转化为DNA。一种逆转录酶执行这种转化,并被用于RT-PCR和逆转录-环介导等温扩增反应(RT-LAMP)之中。但是已存在一些证据证实用于LAMP测定中的嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)DNA聚合酶也能够发挥着逆转录酶的作用。确实,Rovnak已发现这种酶的逆转录酶活性是“非常令人印象深刻的”,这意味着它能够同时执行DNA转化步骤和扩增步骤。

Rovnak说,省掉这个逆转录步骤和使用简单的加热块,当然会让这种检测比RT-PCR测定更加廉价和便于携带。但是,如何首先分离寨卡病毒RNA?Rovnak也有一种简单的现场友好的解决方案。

这种方案就是仅需磨碎携带寨卡病毒的蚊子,将它们加入到含有LAMP反应试剂的试管中,在63° C下孵育,Rovnak团队能够强健地扩增寨卡病毒RNA。在15只感染上寨卡病毒的蚊子中,他们能够准确地全部检测到,而且在3只未感染上寨卡病毒的蚊子中,他们均未检测到这种病毒的存在。

Rovnak团队也证实他们能够直接地从被感染的细胞中区分寨卡病毒非洲毒株和亚洲毒株。

考虑到将这种测定方法用于病人诊断,Rovnak团队接着直接扩增来自被感染者的血浆、血清和精液样品中的寨卡病毒亚洲毒株,不过这也会产生一些假阳性和假阴性。Rovnak说,这是由于“尚不确定的抑制物质”。

Rovnak说,在这种LAMP方法能够成为一种诊断工具之前,它需要更一步的开发,但是鼓舞人心的是,它是与RT-PCR那样是稳健的、准确的和敏感的,但是试剂成本下降了“大约一半”。


原始出处:

Nunya Chotiwan, Connie D. Brewster, Tereza Magalhaes et al. Rapid and specific detection of Asian- and African-lineage Zika viruses. Science Translational Medicine, 03 May 2017, 9(388):eaag0538, doi:10.1126/scitranslmed.aag0538

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发表于 2017-5-8 20:19:25 | 显示全部楼层
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发表于 2017-5-27 08:34:58 | 显示全部楼层
LAMP的专利在日本,容易污染造成假阳性是个问题。
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