[转移贴]B细胞抗原表位的研究方法

cao1976

原贴由xiazhaohe发表于 2007-12-14 11:20
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B细胞抗原表位的研究方法
B细胞识别蛋白抗原时，是以其表面的B细胞抗原受体（BCR）与蛋白抗原表位（抗原决定簇）结合，此过程与抗原-抗体的结合相同。
抗原表位的预测法   该法适用于已知一级结构的蛋白质或多肽抗原的线性表位的预测。人们通过观察抗原表位与已知氨基酸序列的蛋白质某些结构特征关系，发现一些蛋白质的序列或结构特征与抗原表位有关。从80年代Hopp和Woods提出亲水性参数对抗原表位预测的方法以来，已有许多参数、算法发表对B细胞蛋白抗原表位研究起到巨大的推动作用。现已被大众认可并具有较好预测效果的方法，主要有以下6种：
(1) 亲水性方案（Hydrophilicity）常用的有五种方法：Nozaki-Tanford scale、Hopp-Woods scale、Eisenberg scale、Kyte-Doolittle scale和HPLC scale。其中以Hopp-Woods方案最为有名。蛋白质抗原各氨基酸残基可分为亲水残基和疏水残基两类。在机体内，疏水性残基一般埋在蛋白内部，而亲水性残基位于表面，因此蛋白的亲水部位与蛋白抗原表位有密切的联系。Hopp-Woods方案是以残基由有机相环境转移到水相环境的自由能为依据计算各个氨基酸的亲水性。现已明确，亲水性部位与抗原表位并无很好的一致性，即高亲水性部位不一定是表位，表位也不一定是亲水性部位。
(2) 可及性方案（Accessibility）如Janin可及性参数，指蛋白质抗原中氨基酸残基被溶剂分子接触的可能性。它反映了蛋白质抗原内、外各层残基的分布情况。
(3) 抗原性方案（Antigenicity）对20个已研究得很透的蛋白质的69个连续位点的606个氨基酸统计分析，Welling建立了抗原性刻度。每个氨基酸用出现在抗原区的频率描述，此频率除以各氨基酸在所有蛋白质中的频率就可推出此刻度值。该法研究表明，疏水性氨基酸残基对抗原表位形成亦有贡献。缺点是其所用的数据库有限，并且连续位点内的残基被认为是同等重要的。显然那些不重要的残基归入计算会明显降低相关性。
(4) 可塑性方案（Flexibility）指蛋白抗原构象不是刚性不变的，其多肽链骨架有一定程度的活动性，活动性强的氨基酸残基即可塑性大的位点，易形成抗原表位。Karplas和Schulz基于已知结构的31个蛋白质的Cx的温度β因子，发展了一种预测蛋白质片段活动性的方法。
(5) 电荷分布方案（Charge distribution）认为对碱性抗原特异的抗体多趋于酸性，对酸性抗原特异的抗体多趋于碱性。
(6) 二级结构预测方案（Secondary structure）认为β转角结构为凸出结构，多出现在蛋白质抗原表面，利于与抗体嵌合，较可能成为抗原表位。而α螺旋、β片层结构规则不易形变，较难嵌合抗体，一般不作为抗原表位。可预测蛋白质β转角的有Chou-Fasman，Garnier Cohen等方法。其中各种方法预测的成功率均不超过65%。一般认为Cohen方法对转角的预测正确率很高，对于已知折叠类型的蛋白质（αα类、ββ类和α/β类）正确率高达95%，对于未知结构类型的蛋白质，可用3种类型分别预测，3类预测一致的转角对预测表位有帮助。
    用上述各种方案单一的来预测表位，其准确率均不高，最好将多种方案综合考虑。概括而言，作为B细胞表位首先一般位于蛋白质抗原表面，有利于与抗体结合。另外，具有一定柔韧性，因为抗原与抗体结合时蛋白构象有一定的变化。用软件预测出的抗原表位需用实验进一步验证。在实际应用中，常用PCR的方法扩增抗原性强的区域，经克隆、表达，检测表达产物与抗体的反应性，但常因表位预测不准或表达产物没有糖基化、不能正确的折叠而不与抗体反应。
化学“切割”法或酶解法   将纯化的蛋白质多肽用某种化学试剂或蛋白酶切割成若干小片段，经SDS-PAGE胶分离开来，然后转印到硝酸纤维素膜上，再用单克隆抗体或高免血清进行Western blot，检测小段多肽与抗体是否有反应，有反应的多肽片段中就含有抗原表位。使用这种方法需要知道蛋白质的一级结构，并且事先清楚切割片段的大小。在实际工作中可以将蛋白质序列输入Gene Runner，利用工具栏中的“analysis”→“protein”可以列出几种试剂（或酶）的切割位点和切割片段的数量，例如：CNBr可以从甲硫氨酸（M）处将多肽切割成若干小片段。
肽探针扫描技术（Pepscan技术）   Pepscan技术是指合成连续的重叠的短肽，与相应的抗体反应，分析检测结果以确定阳性反应片段。这一技术要求有明确的抗原一级结构，并且检测结果为线性抗原表位，对构象型表位则无法获知，而且合成多肽的费用较高。白雪帆等（2000）利用单抗对人工合成的15肽和8肽两个阵列进行了免疫学的检测，从而确定了汉坦病毒的抗原表位。
    肽库（Peptide library） 肽库是大量的某一长度范围的短肽集合，它包括了该长度的短肽的各种可能的序列或其中的绝大部分，是一种强有力的用于快速研究蛋白质－蛋白质之间相互作用的工具。肽库基本可以分为以下3种类型：有机合成肽库、基因工程肽库和突变体肽库。有机合成肽库就是直接利用固相肽合成技术，合成含有各种可能序列的短肽集合。通过这种合成可以保证各种序列的多肽等几率出现。每个载体上只含有一种序列的短肽，其优点是构建方法简单快速；缺点是不能扩增，价格昂贵。基因工程肽库是指先利用基因克隆技术将合成的一组寡核苷酸混合物（小肽基因混合物）克隆至噬菌体基因组中，使之以融合蛋白的形式在噬菌体的外壳蛋白的氨基端表达（有关噬菌体展示肽库将在下文中详细表述）。突变体肽库是指某一抗原蛋白的一系列突变体的集合，通过其与抗体的结合反应的强弱，判定与该抗体结合的抗原表位的位置，其中的各突变体与天然抗原一般仅有1个氨基酸的差异。构建突变体库的方法有：cDNA突变体文库、PCR方法构建的突变库。对于已经粗略定位的表位来说，可以合成多肽突变体库（组）进行精确地定位。
X-衍射与核磁共振（NMR）分析   抗原-抗体复合物（Ag-Fab）的X射线衍射被认为是真正能够反映抗原、抗体相互识别的一种技术。该技术最初研究抗原抗体相互作用时抗原中氨基酸的参与识别情况以及表位类型（线性或构象型）。但该技术受获得抗原-抗体复合物的晶体的限制。NMR方法可避免结晶，但其只能研究小分子的多肽抗原。由于对设备有特殊要求，所以该技术在一般实验室的应用受到限制。
   蛋白质B细胞抗原表位研究的一些常用方法，在实际应用中，常根据具体情况选择应用。

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