EB病毒疫苗的研究进展*

rentianyixu

摘要：EB 病毒是一种感染最广泛的人类γ 疱疹病毒，与传染性单核细胞增多症、鼻咽癌、Hodgkin’s 淋巴瘤以及 Burkitt 淋巴瘤等发生密切相关。预防和治疗 EB病毒相关疾病一直是研究的热点，预防性疫苗主要以病毒包膜糖蛋白 gp350 为靶点，刺激机体产生抗体以阻止病毒感染；已有多种疫苗进入临床试验，用于预防传染性单核细胞增多症和器官移植后淋巴增殖性紊乱等疾病，并取得良好的试验结果。治疗性疫苗则以病毒复制感染过程中表达的病毒核抗原（EBNAs）和潜伏膜蛋白（LMP1 和 LMP2）为免疫治疗靶点，刺激机体产生特异性细胞免疫应答，增强细胞毒性T细胞杀伤肿瘤作用。国内外均已有疫苗进入针对鼻咽癌等肿瘤免疫治疗的临床试验，试验结果表明疫苗兼具良好的安全性和免疫原性。本文还综述EB病毒疫苗研究的最新方法、策略和成果，并探讨其中可借鉴的技术和思路，为EB病毒疫苗的研究提供潜在可行的新途径。


前言
19 世纪 50 年代，在疟疾流行区域，Burkitt 发现少数非洲儿童患有一种 B 细胞淋巴瘤 （后被命名为 Burkitt 淋巴瘤）；此后，在 1964 年，Epstein、Achong 和 Barr 在培养的 Burkitt 淋巴瘤细胞中观察到一种疱疹病毒 [1]，即 EB 病毒（Epstein-Barrvirus, EBV）。随后，在多种疾病和肿瘤中均检测到EB病毒，如鼻咽癌、胃癌、Hodgkin's 淋巴瘤、传染性单核细胞增多症和获得性免疫缺陷综合症（AIDS）患者的口腔毛状白斑症等[2，3]。世界卫生组织将 EB 病毒归为第一类致瘤病毒，全球每年新增约200,000与EB病毒直接相关的肿瘤病例，其中在新增的 8200例 Burkitt 肿 瘤、930,000 例 胃 癌、62,000 例 Hodgkin 肿 瘤 和80,000 例鼻咽癌中，与 EB 病毒相关的病例数目依次为 6700、84,000、28,000 和 78,000[4，5]。EB 病毒在人群中感染非常普遍，全世界 95%左右的成年人被EB病毒感染[6]，大部分 EB病毒感染发生在婴幼儿时期；但并不引起症状或只产生非特征性的症状，而是建立终生潜伏感染状态[2，7]。EB 病毒作为一种致病病毒，由于其感染的广泛性和普遍性，全球相关领域科学家们一直致力于EB病毒疫苗的研发，以预防和治疗 EB 病毒感染所引起的各种疾病和肿瘤，通过将病毒蛋白以不同形式组合形成重组蛋白，极大限度地阻断 EB 病毒感染和杀伤感染细胞，是EB病毒疫苗研究的发展方向，同时结合生物材料、纳米材料组装功能疫苗，也为EB病毒疫苗的研究注入新的活力；而 EB 病毒的感染具有强烈地种属特异性，只感染人类，导致缺乏有效地动物模型用于临床前评估疫苗预防和治疗效果，这也是目前EB 病毒疫苗研究的难点。本文通过综述以 EB 病毒糖蛋白gp350 为基础的多种预防性疫苗的临床试验结果和以病毒核抗原 EBNAs、膜蛋白 LMPs 为免疫治疗靶点疫苗的治疗效果，以及相应动物模型的构建和基础研究方面的成果，为研发新型的EB病毒疫苗提供潜在的解决方案。
1 EB 病毒
1.1 EB病毒感染路径及致病性EB 病毒是一种含 172 kb 基因组的人类 γ 疱疹病毒，其主要经体液接触途径进入人体；然后通过病毒包膜糖蛋白 gp350与B淋巴细胞表面的CD21 结合、以及糖蛋白 gp42 与人白细胞抗原结合而感染 B 淋巴细胞 [2，8]，EB 病毒还能感染其它细胞，如上皮细胞，在某些情况下还能感染T淋巴细胞、自然杀伤细胞、平滑肌细胞和单核细胞等[9]。EB病毒感染人体后，刺激免疫系统，产生大量细胞因子，首先产生 γ- 干扰素协同 NK 细胞抑制病毒感染的 B淋巴细胞的复制，随后通过特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤被感染细胞。目前认为T细胞免疫应答对控制 EB 病毒感染起决定性作用，也为设计疫苗刺激机体CTL应答来治疗EB病毒相关疾病提供了依据。

EB病毒感染早期一般无症状或产生非特征性症状，但感染青少年或年轻人后，可能导致单核细胞增多症；大概 1%的EB 病毒感染者会出现并发症，如脑炎、肝炎、溶血性贫血或血小板减小症。EB病毒与多种肿瘤的发生发展密切相关，并具有地域性地特点，如鼻咽癌主要发生在我国南方地区，50 岁以上人群鼻咽癌发病率高达 50/100,000；EB 病毒相关的 Burkitt 淋巴瘤主要发生在位于赤道的非洲国家和新几内亚[4，5]。


1.2 EB病毒主要蛋白的研究
EB病毒侵染细胞后，在复制感染过程中共表达 9 种蛋白，其 中 包 括 6 种 病 毒 核 抗 原 （EBNA1, EBNA2, EBNA3a,EBNA3b, EBNA3c 和 EBNA-LP）以及三种潜伏膜蛋白（LMP1,LMP2A, LMP2B）；还有两种 EBV 编码的核糖核酸（EBER1 和EBER2）[10]。EB病毒的潜伏感染形式可分为潜伏III期、潜伏 II期和潜伏 I 期，各个时期表达的蛋白有所不同，也分别与不同种类肿瘤的发生发展相关；潜伏 III 期表达：EBNA1, EBNA2,EBNA3, LMP1, LMP2，与淋巴瘤的发生相关；潜伏 II 期表达：EBNA1, LMP1 和 LMP2，与 Hodgkin's 淋巴瘤和非 Hodgkin's淋巴瘤有关；潜伏 I 期表达：EBNA1，与 Burkitt 淋巴瘤和胃癌密切相关。正由于各时期所表达蛋白不同和致瘤种类各异，因此，在研究特定肿瘤疫苗时，能够有更强地针对性，也可以将两种或多种蛋白整合，以提高疫苗治疗相关疾病和肿瘤的几率[8,11]。EBNA1 是 EB 病毒潜伏感染时表达的一种病毒核抗原，其能调节 EB 病毒的复制，增强病毒基因的转录；并能维持病毒基因组的稳定性，使病毒能以附加体的形式稳定存在于被感染的细胞内。EBNA1 包含多个 CD4 T 细胞的靶向表位，可由特异性 HLA II 类分子呈递给 T 细胞，从而使 EBNA1 成为治疗 EBV相关疾病潜在的靶点。LMP1是 EB病毒潜伏蛋白中研究最透彻的，其表达可诱导 EB 病毒感染和初始 B 细胞活化等一系列变化。包含 HLA A2 限制性 LMP1 肽段的多肽疫苗，能够有效诱发强的 CTL应答，并在 HLA A2/Kb 小鼠体内逆转表达 LMP1 的肿瘤。LMP2 是一种具有促进生长活性的膜信号蛋白，包含 CD8 T 细胞靶向表位，由 HLA I类分子呈递给 T 细胞。在多数 EB病毒相关恶性疾病中，均表达 EBNA1、LMP1 和LMP2，甚至只表达该三种蛋白，而且这三种蛋白都可诱导机体产生 CTL反应；在治疗性疫苗的设计和研发中，通过对这编码这三种蛋白基因进行相应修饰和组合，诱发特异性 CTL应答，达到治疗目的。


2 EB 病毒疫苗的研究现状
2.1 EB病毒预防性疫苗的研究
EB 病毒疫苗的设想，最早可追溯到 1976 年，Epstein[12] 首先提出用疫苗预防 EB 病毒相关的恶性肿瘤或减少其发病率。目前，大部分防治 EB病毒感染疫苗的研究集中于 EB 病毒的包膜糖蛋白 gp350，不仅是因为 EB 病毒通过 gp350 与 CD21结合感染细胞；而且 gp350 是 EB 病毒和被感染细胞上最丰富的糖蛋白，同时也是产生中和性抗体以抵御病毒感染首要的靶标。2007 年，Sokal 等[13]制备的重组 gp350 疫苗进行了 II 期临床试验，试验对象包括 181 位未被 EB 病毒感染、且身体健康的年轻人；试验结果表明：该疫苗预防由 EB 病毒感染引起的传染性单核细胞增多症的有效率达到 78%，并且产生的抗gp350 抗体在体内留存时间超过 18 个月，同时该疫苗具有良好的安全性和免疫原性[14]，目前已着力于 III 期临床试验的设计[4]；但是该重组疫苗不能有效预防无症状的EB病毒感染。2009 年，Rees 等[15]以慢性肾功能衰竭、只能等待器官移植的患者为研究对象，进行了 gp350 疫苗 I 期临床试验，结果表明该疫苗具有良好地生物活性和免疫原性；试验过程中发现，由于研究对象对该疫苗的特定反应，使得从初次接种该疫苗到最终实施器官移植的中值时间为 24 周，从而延迟了移植手术的进行；后续临床试验需要在接种疫苗时使用配套改进地佐剂，以缩短从初次接种到移植的时间，以降低移植后患者体内EB病毒载量和患移植后淋巴增生性紊乱疾病的几率。



2013 年，Cui等[16]在构建gp350载体的时候，以(Gly4Ser1)3为连接体将两段完全一样的 gp350 序列分割开；随后添加酿酒酵母 GCN4亮氨酸拉链序列，利用其自连作用使 gp350 二聚体最终形成四聚体蛋白；并且所采用的 gp350 仅包括其前 470 个氨基酸序列，但包含有 CD21 的结合位点。在研究该四聚体gp3501-470 的免疫原性和有效性时，以单体 gp3501-470 为对照，结果发现：四聚体形式的 gp350，其免疫原性比单体 gp350强 25 倍，与 CD21 结合的效率比单体形式高 24 倍；实验结果也表明，所制备的四聚体 gp350 疫苗，能够有效预防 EB 病毒感染宿主细胞，从而具有作为预防性疫苗的潜力。EB病毒的预防性疫苗主要以 gp350 为靶抗原，通过接种后刺激机体产生中和性抗体以阻断病毒感染通路。确保疫苗的安全性和免疫原性是疫苗研发的首要原则，从上述临床结果可以看出，gp350 疫苗兼具良好的安全性和免疫原性，具有较好的预防效果；但对于无症状地或特定地 EB 病毒感染者不能有效地预防，使得疫苗的适用范围大大减小；具有更强免疫原性的多聚体 gp350疫苗，或许是好的解决方案。


2.2 EB病毒治疗性疫苗的研究
EB 病毒的核抗原 EBNAs 和膜蛋白 LMPs 能够诱发宿主特异性地细胞免疫反应，为免疫治疗提供了基础。目前正在研究中的疫苗主要以 LMP1, LMP2, EBNA1 和 EBNA3 为靶抗原，通过单一或多个蛋白组合，构建病毒疫苗；接种后，诱导机体产生特异性 T 细胞免疫应答，通过特异性地细胞毒性 T 淋巴细胞作用清除表达相应靶抗原的肿瘤细胞，达到治疗效果。



2.2.1 以单一 EB 病毒蛋白为靶抗原的疫苗
2003 年，Duraiswamy等[17]通过重组一个痘病毒疫苗，其包含有编码源于LMP1 的HLA A2- 限制表位的多肽蛋白；以EB 病毒相关的Hodgkin's 疾病和鼻咽癌患者为对象的临床前试验结果表明该疫苗能够有效地被正常人的LMP1 特异性细胞毒性T 淋巴细胞（CTL）识别，产生强烈地CTL 应答；说明该疫苗能够通过免疫疗法治疗EB 病毒相关的Hodgkin 疾病和鼻咽癌。2012 年，尉秀霞等[18]通过构建包含去除癌基因的LMP1△ DNA 疫苗，并与携带LMP1△基因的重组腺病毒疫苗联合接种；初步结果得到，单独的LMP1△基因DNA 疫苗能够诱导产生LMP1△特异性的CTL 应答；与携带LMP1 基因的重组腺病毒疫苗联合使用后，能够提高特异性细胞免疫应答水平。2009 年，杨松梅等[19]联合使用EB 病毒LMP2 的DNA 疫苗、腺联病毒疫苗和非复制5 型腺病毒疫苗接种小鼠，该混合疫苗能够有效地诱导机体产生针对EB 病毒相关鼻咽癌的特异性细胞免疫应答，从而为鼻咽癌的防治提供一种可行的疫苗策略。2012 年，曾毅院士主导研发的重组LMP2 腺病毒疫苗就鼻咽癌的治疗进入I 期临床试验，以验证该疫苗的安全性和生物活性。2008 年，Elliott 等[20]以EB 病毒核抗原3（EBNA3）上的HLA B0801 限制性多肽FLRGRAYGL 为基础，制备出可诱发特异性CD8+ T 细胞应答的疫苗，并进入I 期临床试验；该疫苗旨在诱导针对EB 病毒感染的T 细胞免疫应答，并有效刺激机体产生抗EB 病毒相关的恶性肿瘤；小量样本临床试验结果也初步证明该疫苗能诱导机体产生病毒特异性CD8+ T 细胞应答。以单一病毒膜蛋白或核抗原为靶点的疫苗，在鼻咽癌的免疫治疗方面已取得重要进展；特别是我国自主研发治疗鼻咽癌的重组LMP2 疫苗已进入临床试验，对我国进行鼻咽癌的防治具有重大意义，因为全球80%的鼻咽癌患者在中国。


2.2.2 以多种EB 病毒蛋白为靶抗原的疫苗
2010 年，Lutzky等[21]在设计EB 病毒疫苗时，为最大限度地提高机体的T 细胞（包括CD4 和CD8）识别EB 病毒的几率；利用重叠PCR 技术将编码EB 病毒核抗原1 （EBNA1）、LMP1 和LMP2 的基因合，然后插入到腺病毒载体中；使其在鼻咽癌的免疫治疗中具有激活所有可能CD4+ 和CD8+T 细胞应答的潜能，从而尽可能地识别并杀伤肿瘤细胞，达到治疗目的。2012 年，Chia 等[22]公布了在晚期转移性鼻咽癌患者身上使用一种腺病毒诱导的树突细胞疫苗的II 期临床试验结果，该腺病毒表达部分缺失的LMP1 和全长LMP2，试验结果证实该疫苗兼具安全性和有效性。Hui 等[23]在2013 年报道了在鼻咽癌患者使用重组改良的安卡拉痘苗（MVA-EL）的I 期临床试验结果，该重组疫苗编码EB 病毒的EBNA1 和LMP2，以刺激机体的T 细胞免疫应答。试验实施过程中将不同剂量的疫苗接种不同的病人，结果发现，该疫苗具有明显地剂量效应，即接种疫苗量最多的患者，具有更强地针对EBNA1 和LMP2 的细胞免疫应答；并且兼具安全性和良好的免疫原性、生物活性，为II 期临床试验验证疫苗的临床效果、有效性提供坚实地基础。该疫苗已经从2013 年3月开始进行为期三年的Ib 期临床试验[24]，在更深入细致地研究疫苗安全性、免疫原性的同时，还将探讨免疫系统是如何对该疫苗产生应答、疫苗的副作用以及加强疫苗接种对免疫系统的效应等。


2.3 其它类型的疫苗
2011 年，德国的Ruiss 等[25]制备出一种类病毒材料，其结构与EB 病毒类似，并以此获得一株细胞系，这个细胞系包括有基因修饰的EB 病毒基因组；但是缺失所有潜在的病毒癌基因，只含有供装配、释放等必须的病毒蛋白。体内实验结果表明，这种基于EB 病毒的材料具有很强地免疫原性，能有效刺激机体产生CD4+ 和CD8+T 细胞免疫应答。因此这种类病毒材料不仅安全，也可以作为有效地EB 病毒候选疫苗。这种以类病毒材料为载体，与前述EB 病毒疫苗常用的腺病毒和痘苗病毒载体，兼具安全性和免疫原性，具体临床试验结果有待进一步研究；但无疑为EB 病毒疫苗的研究提供更广地思路和途径。2013 年8 月，H. Polansky 和E. Itzkovitz[26]公布了一种抗多种病毒（包括EB 病毒、人乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人巨细胞病毒和丙型肝炎病毒）药物的上市后临床试验结果，药物名为：Gene-Eden-VIR。该药物包含有五种天然的物质成分：槲皮黄铜、绿茶萃取物、肉桂萃取物、甘草萃取物和硒。根据对60位、年龄在20 岁以上被感染个体的试验结果表明，该药物能够安全、有效地进行抗EB 病毒、人乳头瘤病毒等病毒感染。


3 结论与展望
综上所述，EB 病毒疫苗的研制已经取得令人可喜的结果，多种疫苗已进入临床试验。然而，在疫苗的研究过程中依然存在一些困难：1）在肿瘤的发生发展期，缺乏一个好的肿瘤标志物[4，5]，使得后续的临床试验举步维艰。2）在研究抗EB 病毒感染和相关疾病时，缺乏相应地动物模型。因为EB 病毒具有很强的种属特异性，且只感染人类。早在1985 年，Epstein 等[27]用gp350 接种棉冠绒猴后，能够保护其不患EB 病毒诱导的B 细胞淋巴瘤；但是棉冠绒猴为濒危物种，使得这种动物模型的推广大大受限。2012 年，Zhang 等[28]成功构建出一种临床前的小鼠动物模型，该小鼠能够表达被B 细胞特异性结合的改型EB病毒LMP1；实验结果也揭示了LMP1 在体内被EB 感染的B细胞的免疫监视和转化发挥重要角色，该模型也为B 细胞淋巴瘤的治疗提供新策略。随着科学技术的发展，病毒、疫苗及免疫佐剂等相关方面的研究不断深入，为EB 病毒相关疾病和肿瘤的治疗提供了新的策略。Ogembo 等[29]研究发现人补体受体1（即CD35）也可以做为EB 病毒的受体，CD35 在EB 病毒的初次免疫中扮演重要的角色，为解释病毒趋性及gp350/220 作为EB 病毒疫苗的重要性提供了良好的基础。与此同时，科学家们也致力于佐剂的研究，和疫苗联合作用，提高机体的抗肿瘤免疫。CpG 寡脱氧核苷酸序列能够通过Toll 样受体9 （TLR9） 激活机体的固有免疫，可以作为佐剂加强机体的抗感染和抗肿瘤免疫[30，31]。Zuo 等[32]于2011 报道一种新的靶向基因疗法，用于治疗EBV 相关的鼻咽癌；该方法采用RNA 干扰技术，实验结果发现其构建的非病毒载体mc-oriP-IFNγ 上的增强子oriP 能够特异性地与鼻咽癌细胞的EBNA1 结合；从而使具有抑制肿瘤生长功能的IFNγ靶向到肿瘤部位发挥功能。在EB 病毒疫苗的前期研究基础之上，以及与不断出现的最新研究成果和不同知识体系之间的相互借鉴、交融，对EB 病毒的研究认识更加清晰、透彻，也为EB病毒相关疾病和肿瘤的预防和治疗，奠定了坚实的理论和实践基础。

来源：邹军辉, 万晓春, 王蒲. EB病毒疫苗的研究进展[J]. 现代生物医学进展, 2015, 15(3):543-546.