CRISPR sgRNA设计

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在靶标DNA区域中设计一对20bp左右的oligo DNA， 可以通过以下在线工具设计：

1 麻省理工学院的CRISPR Design：
http://crispr.mit.edu/

2 德国癌症研究中心的E-Crisp：
http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html

gRNA（small guide RNA简称），是CRISPR基因敲除敲入系统中重要的组成部分，早先发现的guide RNA，由两部分组成—tracRNA和crRNA, 两部分融合表达后，即sgRNA也能很好的行使guide的功能，与cas9蛋白结合，引导cas9酶靶向基因组DNA进行剪切。  SgRNA脱靶问题一直备受关注，如何设计特异性好的靶点成为大家关注的焦点，很多实验室开发了不同的设计软件，大体原则如下：
（1）对于sgRNA的长度，一般应为20 nt左右；
（2）对于sgRNA序列的碱基组成，可选3'末端含GG的sgRNA，同时sgRNA种子序列尽量避免以4个以上的T结尾，GC%含量最佳为40%~60%；  
（3）sgRNA的种子序列与脱靶位点的匹配数尽可能低
（4）如果构建U6或T7启动子驱动sgRNA的表达载体，需考虑sgRNA的5' 碱基为G或GG，以提高其转录效率；
（5）对于sgRNA靶向基因的结合位置，如需造成基因移码突变，需尽量靠近基因编码区的ATG下游，最好位于第一或第二外显子；  
（6）检查sgRNA靶向结合位点基因组序列是否存在SNPs；
（7）如采用Cas9单切口酶，设计paired-gRNA需考虑成对sgRNA的间距；  
（8）全基因脱靶效应分析，需考虑脱靶位点最大允许几个错配碱基数，建议最少5个碱基。重点考察种子序列和非种子序列碱基错配数，以及脱靶位点是否位于基因编码区等，另外还可考察是否存在碱基插入或缺失的脱靶位点。
另外SgRNA的活性与CRISPR系统的突变效率直接相关，好的sgRNA靶点，会带来更高的突变效率，更多的阳性克隆，在后期筛选和鉴定时都能事半功倍，所以在着手进行基因编辑前，设计并找到有活性的靶点至关重要。通常在设计特异性靶点后，需要进行体外细胞活性筛选，筛选出有效的靶点用于后续实验。

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如何设计特异性好的sgRNA:
1、        如果软件中有你需要的物种基因组序列，可以在下列网站中设计。
1、http://crispr.mit.edu/
2、http://www.broadinstitute.org/mpg/crispr_design/
3、http://spot.colorado.edu/~slin/cas9.html
4、http://www.e-crisp.org/E-CRISP/
5、http://flycrispr.molbio.wisc.edu/
6、http://www.flyrnai.org/crispr/, Drosophila
7、http://cas9.cbi.pku.edu.cn/index.jsp
8、http://eendb.zfgenetics.org/casot/index.php
9、http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx
10、http://cas9.wicp.net/
11、http://crispr-era.stanford.edu/
12、http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR植物
SgRNA 设计靶序列选择：
根据提供的物种、基因名称或者基因ID在NCBI或ENSEMBLE中进行查找。找到该基因CDS区，分析相应的基因组结构，明确CDS的外显子部分。按照基因本身的性质，选择候选的待敲除位点，确定待敲除位点。对于蛋白编码基因，如果该蛋白具重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确定基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子ATG后的外显子上。如果是microRNA，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显子或在编码成熟microRNA的外显子的5’和3’侧翼序列。
确定待敲除位点后，选择23-至250bp的外显子序列输入到在线免费设计sgRNA的软件Input框中（ http://crispr.mit.edu/ ），然后进行设计运算，软件会自动输出sgRNA序列。
根据设计的sgRNA靶点序列，NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG合成一对序列互补的DNA Oligos。
根据酶切方式，选择合适接头，例如，PX458等质粒sgRNA靶点oligo如下（BbsI酶切）：

5‘-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’
     3‘- CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-CAAA-5’
测序引物：U6-CRISP/Cas9-promoter：gggcctatttcccatgattc

根据需要，设计好的靶点可以用于载体构建，或体外转录sgRNA，进行细胞转染或受精卵注射。