多重连接依赖式探针扩增技术MLPA

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(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)
http://www.mlpa.com/

多重连接依赖性探针扩增(MLPA)是一种高通量、针对待测核酸中靶序列进行定性和相对定量分析的新技术。该技术具有分辨率高、操作简便、设备要求低等诸多优势而广泛用于检测人类基因组内拷贝数变异(CNV)。近年来,MLPA在技术与应用上又有许多新的发展,如运用化学合成法制备3'、5'探针,MLPA在基因甲基化检测、基因表达水平分析、基因部分片段重复区域拷贝数分析及转基因基因分型中的应用,并且MLPA与基因芯片微阵列技术的结合,使得多重连接探针扩增真正具备了高通量检测能力。

多重连接探针扩增检测（MLPA）是一种针对待检DNA序列进行定性和半定量分析的新技术。该技术高效、特异，在一次反应中可以检测40-50个核苷酸序列，目前已经应用于多个领域、多种疾病的研究。包括染色体非整倍体改变，SNP和点突变，染色体亚端粒的基因重排及常见的儿童遗传性疾病的检测。

多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification ,MLPA）于2002年由Schouten等首先报道，是近几年发展起来的一种针对待检DNA序列进行定性和半定量分析的新技术。该技术高效、特异，在一次反应中可以检测45个核苷酸序列拷贝数的改变，目前已经应用于多个领域、多种疾病的研究。
一、MLPA的原理
MLPA的基本原理包括探针和靶序列DNA进行杂交，之后通过连接、PCR扩增，产物通过毛细管电泳分离及数据收集，DNA分析软件对收集的数据进行分析最后得出结论。每个MLPA探针包括两个荧光标记的寡核苷酸片段，一个由化学合成，一个由M13噬菌体衍生法制备；每个探针都包括一段引物序列和一段特异性序列。在MLPA反应中，两个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交，之后使用连接酶连接两部分探针。连接反应高度特异，只有当两个探针与靶序列完全杂交，即靶序列与探针特异性序列完全互补，连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链；反之，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只有一个碱基的差别，就会导致杂交不完全，使连接反应无法进行。连接反应完成后，用一对通用引物扩增连接好的探针，每个探针的扩增产物的长度都是唯一的，范围在 130～480bp。最后，通过毛细管电泳分离扩增产物，Genemarker软件分析，得出结论。只有当连接反应完成，才能进行随后的PCR扩增并收集到相应探针的扩增峰，如果检测的靶序列发生点突变或缺失、扩增突变，那么相应探针的扩增峰便会缺失、降低或增加，因此，根据扩增峰的改变就可判断靶序列是否有拷贝数的异常或点突变存在。

二、MLPA的优缺点 MLPA结合了DNA探针杂交和PCR技术，具有以下优点
1、高效：一次反应可以检测45个靶序列拷贝数的改变。
2、特异：可以检测点突变。
3、快速：一次实验可以在24小时内完成。
4、简便：不同的试剂盒操作基本相同，容易掌握。
MLPA虽然具有很大优点，但也有其局限性
1、需要精确测量DNA的浓度，样本容易被污染。
2、不能用于单个细胞的检测。
3、MLPA用于检测基因的缺失或重复，不适合检测未知的点突变类型。
4、不能检测染色体的平衡易位。
总之，作为一种新的技术，随着医学与生物学的发展，MLPA会日益完善，其应用领域也会日益广泛

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多重连接探针扩增(MLPA)技术同时检测五种病毒的研究
史喜菊  马贵平  乔彩霞  郭志红  张伟  刘全国  李炎鑫  李冰玲  
【摘要】：现有的动物疫病诊断技术多是针对单一病原进行的,而动物疫病的流行却出现了多种病毒混合感染,现有诊断技术不能很好地满足国境口岸快速、高通量检疫的需求,动物疫病多重检测新技术的研究近来已经成为动物疫情监测、疫病控制领域关注的焦点。本研究利用多重连接探针扩增(MLPA)技术特异、敏感、高通量等技术优势,以猪流感病毒(SIV)、伪狂犬病病毒(PRV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪传染性胃肠炎(TGEV)和猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)为研究对象,分别设计了这5种病毒的MLPA探针,将这5种探针混合,建立了可以同时检测这5种病毒的MLPA扩增方法。方法特异性试验表明,针对每种病毒的探针都只能扩增出其对应的病毒模板,其余病毒模板的扩增都是阴性结果;而且,5种探针混合物都只能从单个目的病毒中扩增出单一的特异性条带,而猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的扩增均为阴性。敏感性试验结果表明,5重MLPA扩增的最低检测限可以达到单个病毒核酸3000~6000个拷贝。本研究建立的5种病毒MLPA检测方法在国内外首次实现一次采样,一次分析,检测5种猪病的目的,该技术特异性强,敏感性高,加之其多重性检测优势,有望成为未来疫病检测的新方向。

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MLPA结合RT-PCR快速检测乙型肝炎病毒拉米夫定及阿德福韦耐药
贾双荣  
【摘要】：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)耐药的产生成为长期治疗慢性乙型肝炎成功与否的主要障碍。目前检测HBV耐药的方法多种多样，但都因存在一些缺陷，其临床应用受到限制，例如灵敏度低、耗时长、成本高等缺点。在本论文中，我们建立了一种可以同时检测HBV拉米夫定(lamivudine, LAM)及阿德福韦(adefovir, ADV)耐药突变株(rtM204V, rtM204I, rtA181T, rtA181V, rtN236T)的多重连接探针-实时荧光PCR(multiplex ligation-dependent probe real-time PCR, MLP-RT-PCR)方法。该方法结合了多重连接探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)技术的灵敏、特异、高通量和实时PCR方便快捷、实时检测的特点。通过检测临床116例慢性乙肝患者DNA样本对MLP-RT-PCR方法进行了方法性能评价，其中检测出LAM耐药突变41例(35.3%)，ADV耐药突变17例(14.7%)及两者共同耐药突变5例(4.3%)。检测结果与金标准直接测序方法比较，MLP-RT-PCR检测rtM204V、rtM204I、rtA181T、rtA181V和rtN236T的符合率分别为95.7%(111/116)、98.3%(114/116)、99.1%(115/116)、98.3%(114/116)和99.1%(115/116)。MLP-RT-PCR方法检测低比例突变株的灵敏度比直接测序方法更高，能够检测0.1%以上的rtM204V、rtM204I、rtA181T和rtN236T突变株，1%以上的rtA181V突变株。MLP-RT-PCR发现了4例低比例临床突变株，并进一步被TA克隆测序方法确证。MLP-RT-PCR能够快速、灵敏检测HBV多重耐药突变位点，为临床提供了一种成本低廉、检测快速的乙型肝炎耐药检测方法。

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MLPA(Multiples ligation-dependent probe amplification)，多重连接依赖探针扩增，是一种在同一反应管内检测多达50个核苷酸序列的拷贝数变化的方法。MLPA可以快速同时鉴定几十个基因的缺失和插入，可用于血液，肿瘤样本的DNA，mRNA的表达谱分析。而且，MLPA方法可用于甲基化分析。MLPA已经证实是可信而可靠的方法，目前已广泛应用于全世界900多个实验室，使用该技术发表的论文已近千篇。

MLPA目前的应用领域：
1.检测小的重排：BRCA1，BRCA2，MSH2，MLH1，DMD，APC，SMA，NF1，NF2，VHL，TSC1/2，MECP2，NSD1，LDLR，FBN1，CFTR，DPYD，COOL5A1，CACNA1A，PKHD1，BRIP1，SLC26A4，LNM1B，PRSS1，FRMD7，TPMT，FLCN，DNAI1，EP300，DNAH5，UBE3A，PCCA，PCDH15等。
2.检测大范围的染色体重排：williams syndrome，prader-willi/angelman syndrome，digeorge syndrome，cri du chat，pelizaeus-merzbacher，CMT1，HNPP等。
3.检测亚端粒区的拷贝数改变。
4.检测染色体非整倍体改变，（包括羊水样本）。
5.肿瘤诊断：ALL，CLL，Oligodendrogliomas，melanomas，neuroblastomas等病的拷贝数改变。
6.甲基化定量检测：Parader-willi、angelman syndrome，beckwith wiedemann，MGMT，MLH1，Fragile X，抑癌基因的失活。
7.mRNA分析细胞凋亡和炎症反应。

MLPA的特点：
1.基于PCR的反应，一个反应同时检测多达50个基因组DNA序列的拷贝数。
2.样本量要求：只需20 ng 人DNA，羊水0.5 ml 约3000个细胞。
3.能区分一个碱基的差异的核酸序列。
4.反应条件优化，所有试剂盒基本适用同一反应条件，试剂盒包含了所有必需试剂。
5.高通量：24小时内得到结果。
6.仪器要求：只需普通PCR仪和测序仪。
7.检测范围：从点突变到大染色体缺失/插入均能检测。

MLPA反应条件（one-tube MLPA protocol）：
1.DNA变性：98度加热5分钟。
2.杂交：加入SALSA探针混合物和buffer于95度孵育1分钟，然后于60度杂交16个小时。
3.连接：加连接酶和buffer于54度孵育15分钟。再于98度加热5分钟使连接酶失活。
4.加引物：dNTP，聚合酶，然后开始PCR扩增。
5.毛细管电泳：输出片段长度和峰面积，软件分析结果。

MLPA的优点：
1.MLPA技术能用于检测许多不同的疾病，差别只是探针不同而已。
2.MLPA是多重反应，一个反应提供了将近50个靶位点。
3.MLPA反应费用较低。
4.MLPA重复性好，简单易操作，可以同时检测多个样本。
5.MLPA敏感性高，仅需20 ng 人DNA，结果不受样品DNA量的影响。
6.MLPA能区分单个碱基的差异，能检测少量的拷贝数改变，如2个，3个拷贝数改变。
7.MLPA可以检测单一外显子的缺失和插入突变。
8.所需仪器易得到。