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QRT-PCR用引物设计方案总结

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病毒学院中学生

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发表于 2016-7-26 22:08:52 | 显示全部楼层 |阅读模式
概述:

QRT-PCR过程中,由于涉及到模板定量,所以要求引物特异性强,并且不能扩增出基因组DNA(如果用DNA酶处理干净另当别论),所以要求跨外显子设计(可以不用考虑基因组DNA污染),或跨内含子设计(检验DNA酶是否处理干净,即无基因组DNA污染)。下面是自己在设计过程的一些心得体会,与大家分享之!

要求:

1.      上下游引物的长度一般为18-30bp之间,且Tm值在58-62℃之间,上下游引物的Tm值相差最好不超过2℃。

2.      GC=30-80%

3.      应避免引物中多个重复的碱基出现,尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。引物的3’端最好不为G/C。引物3’端的5个碱基不应出现2G/C

4.      PCR扩增产物长度:引物的产物大小不要太大,一般在80-250bp之间都可;80150 bp最为合适(可以延长至300 bp);

5.      要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在;

6.      而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力,即引物应该跨外显子,最好是引物能跨外显子的接头区,这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响;

7.      至于设计软件,PRIMER3,PRIMER5,PRIMEREXPRESS都可以的;

8.      关于BLAST的作用应该是通过比对,发现你所设计的这个引物,在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中,除了和你的目标基因之外,还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列,如和你的目标序列之外的序列相同的序列,则可能扩出其他序列的产物,那么这个引物的特异性就很差,从而不能用;

9.      避免引物内出现反向重复序列形成发夹二级结构,同时也应避免引物间配对形成引物二聚体。

设计方案:
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发表于 2016-7-27 20:12:29 | 显示全部楼层
给大家推荐一个QRT-PCR引物的网站——primerbank,输入基因名称或者基因号,可以选择那些验证过的引物(绿色标记)

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病毒学院大学生

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发表于 2016-7-29 13:00:54 | 显示全部楼层
好好学习了

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病毒学院小学生

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发表于 2018-11-30 17:31:23 | 显示全部楼层
谢谢分享,有没有测病毒在体内拷贝数方面的详细资料啊,感谢!

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病毒学院小学生

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发表于 2019-5-8 11:52:20 | 显示全部楼层
谢谢,总结很实用,点赞一下

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病毒学院小学生

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发表于 2023-4-12 15:02:49 | 显示全部楼层
学习学习

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病毒学院小学生

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发表于 2023-9-4 19:31:17 | 显示全部楼层
感谢了,学习到了
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