平滑肌细胞原代培养方法

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动物:大鼠150～180g,2～3只
操作步骤
大鼠颈椎脱臼致死
固定
消毒胸腹部
大组织镊,组织剪切开胸腹部皮肤
另一组织镊,组织剪切开胸腹部,并切除部分胸壁以利暴露
眼科镊和眼科弯剪分离胸腹主动脉并放入盛有Hank's液的细胞培养皿中,转入无菌室.或先用生理盐水漂洗,再放Hank's液中,转入无菌室
眼科直镊和弯镊去除血凝块和血管外膜层.
放入另一盛有Hank's液的细胞培养皿中,剪去血管外的小分支
放入含20%胎牛血清的DMEM中,眼科直剪剪开血管腔,以眼科弯镊轻轻擦拭内膜层,以去除内皮细胞
放入另一含20%胎牛血清的DMEM中,用眼科弯剪剪碎血管组织至1mm
用吸管把组织块转入玻璃培养皿中,均匀贴壁,组织块的间距为0.5cm
盖好瓶盖,轻轻翻转培养瓶,让瓶底朝上,并向瓶内注入适量培养液,于37 C孵箱内放置4～5小时,使得组织块干涸,并与瓶底贴附
将培养瓶慢慢翻转平放,使组织块完全浸入培养液中,继续静置3～5天,切勿移动.待有细胞从组织块周围游离出后换液
平滑肌细胞传代
传代时间:大部分组织块长出细胞晕,并与相邻细胞晕相接触时就可以传代
传代步骤:
倒掉培养瓶中的培养液
用D-Hank's液洗两遍
加2-3滴0.25%胰蛋白酶消化液,平放培养瓶,在倒置纤微镜下观察细胞消化情况,可见到细胞质回缩,细胞间隙增大时迅速翻转培养瓶,使细胞脱离消化液
注意:
初次传代对胰酶敏感,加入消化液30s,即消化充分,以后2分钟左右
细胞消化完成后,用吸管反复抽吸打散细胞
中止消化:加入DMEM培养液3滴管,用吸管反复吹打瓶壁细胞
离心:1500 X5分钟
倒掉液体,加D-Hank's液洗一次,再加10mL DMEM培养液,用吸管抽吸吹打分散细胞,分装于2个培养瓶.在倒置纤微镜下可见圆形细胞.放入细胞培养箱中培养
血管平滑肌细胞的冻存和复苏
冻存时间:较早期传代,以防细胞因为传代次数过多而造成细胞衰老或发生改变,以保持实验条件的一致性.
冻存方法:冻存前24小时更换培养液,冻存时要将密闭好的冻存管依次放于:
4 C 2小时
-20 C 2.5小时
液氮表面 2小时
浸入液氮        
培养细胞的鉴定
1,形态学鉴定:
用相差显微镜常规观察细胞生长形态以及生长规律.并依据常规制作电镜标本进行观察
电镜观察结果:细胞形态不规则,胞浆内有肌丝,纵向排列,有密区,具备平滑肌细胞特征
2,免疫组织化学鉴定:
特异性鼠抗α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体,采用SP法对细胞爬片进行免疫组织化学染色
免疫组织化学鉴定结果:
镜下观察到细胞爬片,可见细胞浆内大量平行阳性染色胞核不着色.所有细胞染色,结果均为阳性


培养试剂的配制
Hank's液 (单位g)
CaCl2 0.14
KCl 0.4
KH2PO4 0.06
MgSO4.7H2O 0.10
NaCl 8.0
NaHCO3 0.35
Na2HPO4.12H2O 0.12
D-glucose 1.0
Phenol red 0.01
将 CaCl2先溶解在100mL的ddH2O中,其它成分溶在750 mL的ddH2O中,混匀(用磁力搅拌器搅拌至溶解),定容至1000mL.高压蒸气消毒10分钟,4℃冰箱保存.
D-Hank's液 (单位:g)
KCl 0.40
KH2PO4 0.06
NaCl 8.0
NaHCO3 0.35
Na2HPO4.12H2O 0.08
Phenol red 0.02
将以上成分溶于900mL ddH2O中,充分混匀,加ddH2O至1000 mL.高压蒸气消毒10分钟,4℃冰箱保存.
青霉素,链霉素液配制
青霉素80万U加Hank's液至80 mL,终浓度1万u/ mL
链霉素100万U(相当于1g)加Hank's液至100 mL,终浓度10mg/mL
分装后至-20℃冰箱保存.
DMEM培养液
900 mL ddH2O于1000 mL容器中,将DMEM粉1包倒入容器中,盛粉袋用50 mL ddH2O分次冲洗,也倒入容器,磁力搅拌溶解.
加NaHCO3
调PH至7.2

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　　另外，在体外实验中，来自幼龄动物（兔，猪）的血管平滑肌增殖生长早且快，相反，老龄动物则生长缓慢。在生化性质方面，收缩型细胞比合成型细胞的β-极密度脂蛋白（β-VLDL）对其受体结合能力强，低密度脂蛋白（LDL）分解降低，即脂质容易在胞质沉着。此外，像基底膜中的肝素样物质、胆固醇代谢等也有改变。合成型细胞内色素C氧化还原酶成倍增加，酸性磷酸酶亦呈3～4倍增加，说明 两类细胞不仅在形态学上，在生化、生理反应方面也发生了较大改变。

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