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[细菌] CRISPR-Cas9也能用于嗜热菌基因组编辑

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发表于 2017-2-16 08:29:29 | 只看该作者 回帖奖励 |倒序浏览 |阅读模式

在本研究中,作者利用spCas9成功在芽孢杆菌ET138(Bacillus smithii ET 138/ET 138)中运用,该菌生长温度较宽,可在37°到65°温度之间生长。

经过实验测得,spCas9在ET 138体内只有在37°的情况下才会作用,而当温度达到42°以上时,spCas9在ET 138体内是没有切割活性的,于是利用这一点作者形成了一个单质粒的CRISPR系统,该质粒上包括同源修复用的同源臂、spCas9,、sgRNA表达框,利用温度来控制spCas9的表达。基因组编辑工作首先在55度下进行,让菌液在55度条件下培养24小时,尔后每隔24小时用新鲜的培养基重新培养菌体,放置的温度从55°逐渐降到37°,然后又将温度逐渐从37°上升到55°。经过实验证明,该系统的效率为50%左右。

为了提高效率和运行速度,研究者将从55°降温到37°过程的循环次数从原来的4次降到1次,在每个温度的培养时间减少到8到16小时。

研究者利用这套系统,成功实现了ET 138的基因组中基因的敲除、敲入。该操作程序可在一个星期内完成基因敲除/敲入,其中包括质粒丢失的时间,该系统可实现100%基因敲除,90%基因删除,20%基因敲入。该系统适用于内源的修复系统较强且生长温度较宽。


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