猪流行性腹泻病毒（PEDV）：病毒学和血清学诊断方法综述

序道

   PEDV能引起猪的急性、高度传染性和严重的肠道疾病，会导致哺乳仔猪的高死亡率。2010年末，变异PEDV毒株导致我国PED的大暴发，造成了一百多万头仔猪的死亡。2013年美国也暴发了变异PEDV导致的PED。之后变异PEDV毒株导致了世界范围的PED大暴发，给全球生猪产业造成了灾难性的影响。及时准确的诊断是防控PED的关键之一，本文介绍了PEDV感染后的动力学、宿主反应特性以及PEDV的病毒学和血清学诊断方法。

一、我国PEDV遗传变异和流行情况简介

    下图1为亚洲PEDV毒株基因组的高变区（图1A）和PEDV的基因组结构（图1B）。PEDV基因组中高变区主要位于NSP2、S、ORF3和N基因。因此PEDV分子诊断常依据较为保守的ORF1和M基因。同时由于经典和变异PEDV毒株的核苷酸序列的主要差别位于S基因，所以S基因可作为PEDV毒株的鉴别诊断。作为主要膜蛋白的S和M蛋白，常作为免疫诊断的靶标。

图1 亚洲PEDV毒株的高变区（A）和PEDV的基因组结构（B）（摘自Sun et al., 2015）

    为了更好的诊断PEDV，首先要了解我国不同PEDV毒株的流行特点。我国PEDV毒株的遗传变异性较大，主要分为经典毒株和变异毒株两个大群，经典毒株又可以分为两个亚群（Ca和Cb）其中Ca主要是经典毒株的临床野毒株，Cb主要是由经典毒株衍生的疫苗毒株；变异毒株大群又可以分为三个亚群，分别为Va、Vb和Vc，其中Va为主要的亚群。不同类型毒株在我国大陆地区广泛分布，现阶段变异毒株中Va亚群为主要的PEDV毒株类型（图2）。

图2 依据进化分析得到的我国大陆地区405株不同类型PEDV毒株的地理分布（摘自Chen et al., 2016）

二、PEDV感染的动力学和宿主反应特性

粪口传播感染后，PEDV在小肠上皮细胞中复制，很快导致感染细胞的破坏和坏死。经过一个孵育阶段（在仔猪中为1天，在3周大小的断奶仔猪中的时间为3-6天）就会观察到临床症状包括腹泻和呕吐，并且会持续5-10天（图3）。PEDV感染后很短时间就会发生排毒现象，这一过程可以长达24-30天。感染后的12h在1天大的仔猪和感染后14天的3周大断奶猪的十二指肠和回肠中能检测到病毒抗原。

PEDV感染6-14天就能检测到抗体。主要检测依据PEDV S和N蛋白的抗体反应。N蛋白特异性的IgM反应在感染后7天达峰值，S蛋白特异性的IgM反应在感染后的14天达峰值。N蛋白和S蛋白特异性的IgG反应在感染后第7天第一次检测到，这两种到达峰值的时间分别是21和14天（图3）。S蛋白特异性的分泌性（s）IgA动力曲线和S蛋白特异性的IgG反应类似，感染后7天能测到低水平反应，感染后14天到达峰值，维持时间可以长达6个月（图3）。PEDV特异性的抗体可以在口腔液中检测到。IgA似乎是口腔液中主要的抗体类型，感染后的100天都在不断的增加。PEDV的中和抗体在感染后的7-14天检测到，在感染后21天达到峰值（图3）。中和抗体能在感染后持续6个月的时间。病毒感染动力学和宿主反应特性对于诊断前的采样和样品的检测方法的选择十分重要。

图3 PEDV感染的动力学和宿主反应特性（摘自Diel et al., 2016）

三、PEDV的诊断

当今PEDV的诊断技术主要分为两种：病毒学和血清学诊断方法，下面我们简要的介绍一下这些方法的特点：

3.1 用于检测PEDV或其抗原的方法

3.1.1 PEDV分离

Vero细胞系是用于分离PEDV的主要细胞系。典型的细胞病变性（CPE）是细胞融合、形成合胞体最终细胞脱落。成功分离后主要通过免疫荧光（IF）和RT -PCR方法鉴定。

表1 不同PEDV诊断方法的特性分析

分类	方法	原则	测试样品	相对敏感性	文献
检测活病毒	病原分离	通过细胞培养物分离病原	小肠，肠内容物	非常低	Chen et al. (2014)
检测病毒抗原	免疫荧光（IF）	用抗体检测细胞培养物或组织中病毒抗原	细胞培养物，小肠	+++	Jung et al. (2014)
	免疫组化（IHC）	用抗体检测组织中病毒抗原	小肠	+++	Guscetti et al.(1998)
	抗原ELISA	用一对抗体检测或捕获固相中的PEDV抗原	粪样	+++	Carvajal et al. (1995)
检测病毒RNA	RT-PCR	特异性的扩增病毒核苷酸	直肠拭子，粪样，小肠，小肠内容物，口腔液	+++	Kubota et al. (1999)
	定量RT-PCR	特异性的扩增引物和荧光探针为基础的PEDV RNA检测方法	同上	+++++	Miller et al. (2016)
	LAMP-RT-PCR	特异性引物等温扩增PEDV RNA	同上	+++	Yu et al. (2015)
检测宿主抗体反应	病毒中和和荧光中和反应（VN/FFN）	检测抗体中和病毒感染性的能力	血清，也在初乳和乳汁中检测到	++	Clement et al. (2016)
	间接免疫荧光（IFA）	PEDV感染细胞培养物中血清抗体的检测	血清	++	Clement et al. (2016)
	间接ELISA	通过固定的抗原和抗猪的二抗两步检测血清中的抗体	血清，也用于口腔液的检测	+++	Okda et al. (2015)
	阻断ELISA	竞争的抗体和血清混合竞争固相中的抗原	血清	+++	Okda et al. (2015)
	荧光微球免疫（FMIA）	通过偶联荧光珠的抗原检测PEDV抗体	血清	+++	Okda et al. (2015)

3.1.2 免疫荧光方法（IF）

该检测的原理是在细胞培养中免疫检测病毒抗原（抗体抗原反应）或运用超薄切片方法检测怀疑PEDV感染的猪组织。荧光显微镜下可见感染细胞的细胞质中荧光病毒抗原。临床症状开始后的72h后依然可以通过免疫荧光方法检测PEDV抗原。

3.1.3 免疫组化方法（IHC）

IHC是通过免疫方法和化学方法检测猪组织中的PEDV抗原。和上述的IF类似，临床症状出现前一天和感染后的14天都能通过IHC方法检测PEDV抗原，IHC可以观察到感染目标细胞以及感染过程中的病毒抗原组织分布。

3.1.4 抗原ELISA方法

运用抗原捕获ELISA方法，可以从粪样中检测到PEDV抗原。固相中包被特异性的PEDV捕获抗体，当加入样品后能用特异性的捕获PEDV抗原。该方法受很多临床因素的影响，因此建议在急性感染期采集样品、在临床症状开始很短的时间采集样品和通过冷链运输到检测实验室。

3.2 依赖多聚酶链式反应（PCR）的PEDV核酸检测方法

3.2.1 常规的RT-PCR诊断方法

包括单重的和多重的，这种方法很多被更加敏感和快速的实时荧光定量RT-PCR方法所取代。

3.2.2 实时荧光定量RT-PCR方法

主要包含两种常用的方法：（1）可嵌入双链的非特异性荧光染料；（2）序列特异性的含有荧光报告基团的核苷酸探针方法。这些方法的特点是检测敏感性、利用扩增反应同时检测目标序列的能力、能够进行高通量的检测能够自动化操作。其还能同时检测和鉴别不同类型的PEDV毒株。

3.2.3 等温扩增检测

环介导等温扩增方法（LAMP）是一种简单特异成本效益高的核苷酸扩增方法。这种方法采用能识别6-8个区域的4-6种引物以及有链置换活性的Bst DNA多聚酶进行反应。在一些没有热循环仪或实时荧光定量一起的场合，LAMP因为其敏感性、特异性、低成本、反应要求低等特点可以作为一种替代诊断方法。

表2 PEDV RT-PCR相关诊断

检测方法	目标	敏感性	文献
RT-PCR	M蛋白	101 TCID50/mL	Kim et al. (2000a,b)
	S蛋白	101 TCID50/mL	Kim et al. (2001)
定量RT-PCR	N蛋白	10-2.2 TCID50/mL	Miller et al. (2016)
		无数据	Pasick et al. (2014)
		4.8 log10 （粪样）和3.8 log10 （血清） GE/mL	Jung et al. (2014)
		1 TCID50/mL	Kim et al. (2007)
	S蛋白	10-0.2 TCID50/mL	Miller et al. (2016)
		5×102 DNA copies/L	Zhao et al. (2014)
		2.1×103 DNA copies/L	Zhao et al. (2013)
	M和S蛋白	1 DNA copy/L	Wang et al. (2014a,b)
LAMP-RT-PCR	M蛋白	10-1 TCID50/mL	Yu et al. (2015)
	N蛋白	(100.75 TCID50/mL)	Ren and Li (2011)

3.3 血清学检测方法用于检测PEDV特异性的抗体

3.3.1 间接免疫荧光方法（IFA）

IFA是依据抗原抗体反应建立的方法。PEDV感染的Vero细胞培养物作为抗原底物，来检测疑似感染动物血清中的抗体。如果样品为阳性，PEDV抗体和固相的抗原结合，第二步这些抗体通过荧光标记的抗PEDV二抗检测并通过荧光显微镜观察。

3.3.2 病毒中和实验（VN）

VN被广泛用于PEDV特异性抗体的检测。VN的定义是抗体介导的病毒感染能力的降低。特异性抗体通过和病毒结合阻断了病毒一个和多个复制步骤，导致了病毒颗粒的聚集或溶解，因此中和或者减少病毒的感染性。最近，荧光中和反应（FFN）被用于PEDV诊断，因为PEDV抗体能比CPE更早的检测到，与常规VN相比，FFN能更快的检测分析。FFN检测中梯度稀释的血清和相同量的PEDV孵育，因此能让抗体和病毒结合。抗体和病毒的混合转移到敏感的Vero细胞系培养。PEDV感染性用抗PEDV的荧光抗体检测。

3.3.3 ELISA方法

两种方法用于了PEDV抗体的检测，一种是间接ELISA方法，另一种是竞争或阻断ELISA方法。间接ELISA方法主要通过全病毒或者细菌表达的重组蛋白来检测。这种方法中病毒抗原被固定在固体聚苯乙烯表面，并与测试样品孵育，以允许抗体抗原复合物形成。竞争或阻断ELISA方法是在PEDV特异性的单抗或多抗的基础上面建立起来的。当与测试样本一起加入抗原包被微孔板中后，与血清中的抗体竞争微孔中固定的抗原。

3.3.4 荧光微球免疫（FMIA）方法

FMIA在一种流体荧光微球激光扫描系统基础上面建立，它与ELISA方法比较具有的优点是：分析灵敏度更高、样品通量高、重复使用的能力以及同时检测多个病原的能力。FMIA是依据荧光微球偶联特定病毒抗原的特性；然后抗原特异性抗体通过一个生物素/链霉亲和素/荧光团检测系统检测。抗原抗体反应利用双激光仪器检测，结果表示为平均荧光强度（MFI）。

四、总结

快速和准确的检测PEDV是有效控制PED的关键之一。了解我国当今PEDV的流行现状和流行性特点能让我更有针对性的设计和选择检测方法。了解病毒感染动力学和宿主反应特性对于诊断前的采样和样品的检测方法的选择十分重要。病毒学检测方法能让人们快速鉴定PEDV并将其与其他猪肠道病原鉴别开，血清学检测方法提供关于PEDV感染之前和感染率的有价值的信息。血清学检测还能还能用于评估临床的新疫苗和新免疫策略。免疫方法比如ELISA和FMIA等还能用于评估PEDV同型特异性免疫反应。

本文主体内容翻译于文章：Diel D G, Lawson S, Okda F, et al. Porcine epidemic diarrhea virus: An overview of current virological and serological diagnostic methods[J]. Virus research, 2016, 226: 60-70

来源于 Leman养猪大会微信公众号