利用高通量测序筛查未知病毒的相关技术研究

hantavirus

【作者】 安小平；
【导师】 李敬云； 童贻刚；
【作者基本信息】 中国人民解放军军事医学科学院， 微生物学， 2014， 博士

【摘要】 新发传染病的快速筛查是及时发现和有效控制传染病疫情的关键步骤之，高通量测序是目前发现未知病原体的最有效的手段。市场上流程化的高通量测序是对疑似病原体的样品总核酸进行提取，对病原体及大量的背景核酸进行测序，这些背景核酸包括样品宿主的gDNA和rRNA等核酸，占用了大量的测序资源，严重影响病原体的数据量，在数据分析时还会严重干扰病原体的筛查。而且，传统的病原体高通量测序对于核酸的量和质量要求较高，很多来之不易的珍贵样品，由于样品量少浓度低质量差，难以满足常规测序要求，而被很多测序公司拒之门外。本研究旨在研究高通量测序样品的预处理方法和扩增方法，不但能对常规样品进行病原体筛查，尤其是对量少、质量差的样品依然能进行病原体筛查，并且尽可能多的获得病原体的相关信息，为后期的生物信息分析提供更好的数据。在本论文中分别对不同来源的样品进行病原体筛查，包括来自于呼吸道的咽拭子样品、来自于人体的血液样品和来自环境的虫媒标本等。本论文的主要研究内容如下：首先进行了Sanger测序和高通量测序的比较，在初步判断为腺病毒感染后，开展病毒全基因组序列分析：Sanger测序+454深度测序，比较和分析各方法的适用性。Sanger测序以腺病毒11a型为参考序列设计引物，进行PCR扩增，然后对PCR产物进行直接测序。对这些序列进行拼接，获得序列总长28737bp，相当于病毒全基因组（34.7kb）的82.7%。454无偏性（unbiased）深度测序采用咽拭子gDNA直接测序和特异引物扩增两种方案，咽拭子基因组直接454测序结果显示：在74万条测序结果中，仅有23条序列为腺病毒序列，经过拼接，获得序列总长6215bp，仅相当于腺病毒基因组全长的17.9%，对于腺病毒基因组全长的拼接贡献很小。产出数据中超过90%的序列来源于人的序列，还存在大量正常菌群脑膜炎奈瑟斯菌，但是未发现与疫情相关的其他病原体。咽拭子gDNA特异引物扩增454测序结果显示：在20多万条测序结果中，有3125条为腺病毒序列，经过拼接，获得序列总长33070bp，相当于腺病毒基因组全长的95%。很显然，不管是Sanger测序还是454深度测序，特异性扩增产物的基因组覆盖效果更好，分析咽拭子gDNA直接测序的数据，筛查到了腺病毒的序列，从而确认本次疫情由腺病毒感染引起。在禽流感爆发时期，我们对大量的禽类拭子样品进行禽流感病毒筛查，首先利用实时定量PCR进行初筛。结合实时定量检测结果，设计了3套方案分别对低、中、高不同禽流感病毒滴度的样品进行扩增。按照上述3个扩增方案共处理样品167份，共获得33株禽流感病毒基因组序列，包含7株全长的禽流感序列，19株病毒大部分片段，7株病毒获取少量片段。经分析发现，部分毒株还存在混合感染现象，经SNP步移法分离到了不同毒株的全基因组序列，这些数据为后期禽流感变异和进化分析提供了依据。原始样品中存在过多的背景核酸，本研究利用核酸酶消化去除背景核酸，再进行核酸提取，得到极少量的核酸。对于微量样品，分别用以下不同的非特异性扩增方法，放大核酸的量来满足建库需求。首先本研究采用了MDA技术扩增，该扩增方法的模板为DNA，将RNA病毒反转录成cDNA，根据是否合成第二条链分为单链MDA和双链MDA扩增，经过扩增，测序，获得大量的Torque teno病毒(Torque Teno virus，TTV)序列，经过拼接，获得TTV全长基因组（命名为TTV-Hebei-1），序列分析显示，该病毒为株新型的TTV病毒，与现有TTV病毒的同源性很低。同时还发现了株新型噬菌体（IME-16），序列比对显示，该噬菌体与现有病毒的同源性很低，仅与株已知的单链环状DNA病毒--衣原体噬菌体存在较低的蛋白质序列同源性。上述结果表明MDA扩增技术特别适用于环状DNA病毒的扩增。然后本研究分别采用SISPA技术和MDA技术对HCV病人的血清核酸进行扩增，重点观察这两种方法对于RNA病毒的扩增效率，结果发现MDA库产出的数据中与HCV匹配的数据极少，占病毒序列总数不足0.1%（仅有4条），基因组覆盖率仅为6%；SISPA库中几乎都是与HCV匹配的数据，超过病毒序列总数的99.9%，近十万条序列与HCV匹配的序列，基因组覆盖率并不高，仅为28%，部分序列基因组覆盖倍数过高，这与SISPA技术扩增的特点有关，扩增产物较短，优势序列过度扩增。经典的SISPA技术需要采用不同的体系分别扩增DNA病毒和RNA病毒的基因组序列，为了同时检测DNA和RNA病毒，本研究对现有SISPA技术进行了改造，在进行RNA逆转录之前增加步变性步骤，结果能有效检测到同样品中的HBV和HCV病毒。最后本研究采用MDA扩增技术和锚定随机PCR技术扩增HBV、HCV、TTV病人的混合血清标本，以原始样品未经核酸酶消化并且未经扩增作为对照，分析比较不同扩增方法的测序效果。结果发现未经扩增直接测序产生的134万条序列几乎全是人的序列，仅获得少量的HBV序列（61条），而HCV仅有1条，未发现TTV的相关序列。单链MDA扩增获得了更多TTV的序列，而双链MDA获得了更多HBV的序列，锚定随机PCR也是HBV序列占据绝对优势。造成这种偏倚的测序结果可能是不同扩增方法对不同模板的偏好性导致的。蚊子可携带多种病原体，是多种疾病的传播媒介。为了对其携带的病原体筛查进行筛查，本课题组曾经从小RNA测序数据中意外地发现了多种病毒。在此基础上，我们对小RNA测序方法加以改进，提高RNA测序片段的长度以增加核酸序列的特异性，同时采用相应的手段减少rRNA的序列，同时简化样品处理流程，进行RNA直接建库测序，最后我们获得了株蚊子X病毒MXV-W3。经过拼接，获得该病毒片段A序列的95.1%，片段B序列的92.8%，基因组覆盖较完整，仅有少数缺口。利用上述的结果证明MXV可以不依赖登革热病毒单独存在。上述结果显示，要想从样品中获得更多的病原体信息，在测序前，样品预处理及选用扩增方案非常重要，选择样品预处理和扩增方案同时还应该考虑到根据实验目的和病原体的种类。

序道

童研究员是一位不错的研究员，高通量测序做了挺多，手里有台测序仪，做这方面就是方便