昆虫细胞表达系统 总结

樽满秋华

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杆状病毒培养方法
一、相关介绍：
杆状病毒2昆虫细胞表达系统其表达产物的生物学特性与天然产物相似,具有可糖基化、磷酸化、酰胺化、信号肽和蛋白切割等后加工修饰功能,而且具有很高的克隆容量,表达产量高,细胞培养简单,适合大规模生产等优点,现已被广泛的用于各种外源基因的表达,
1 　杆状病毒- 昆虫细胞表达系统
杆状病毒的生物学特性　杆状病毒是一类以昆虫细胞为天然宿主的核型多角体病毒(Nuclear Polyhedrosis Virus ,NPV) ,其基因组为80～160 kb 大小的单一闭合双链DNA ,具有较大的柔韧性,可以容纳较大片断的外源基因插入。目前研究较多的是苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV) ,其宿主是草地贪夜蛾( S podoptera f rugiperda ,Sf) 。AcNPV 的基因表达分为立早期表达、早期表达、晚期表达、极晚期表达4 个阶段。其中在极晚期基因表达过程中有两种高效表达的蛋白:多角体蛋白和P10 蛋白,其基因启动子具有效强的启动能力。多角体蛋白是形成包含体的主要成份,感染后期在细胞中的累积可高达30 %～50 % ,是病毒复制非必需成份,但对于病毒粒子有保护作用。P10 蛋白也是病毒复制非必需成份,可能与细胞溶解有关〔2〕。如将外源基因取代多角体蛋白基因构成重组病毒,病毒体内不含有包含体。不形成包含体的病毒和形成包含体的病毒在平板中形成的空斑不同,利用这一特征筛选含有外源基因的重组病毒。
杆状病毒-昆虫细胞表达系统的优越性　与其他表达系统相比,杆状病毒表达系统具有以下的优越性：(1) 安全性:杆状病毒具有高度的种属特异性,不感染脊椎动物,相对于其他病毒载体,如腺病毒、痘病毒等载体而言,其安全性好。(2) 容量大:杆状病毒基因组较大,具有多个天然启动子,也易于构建新的人工启动子,可实现多基因表达,可容纳大片断外源基因,因此可同时插入多个外源基因,而形成病毒样颗粒(virus - like particle ,VL P) ,提高疫苗的免疫活性。(3) 表达效率高:与其他真核表达系统相比,杆状病毒系统可以高效地表达外源基因, 表达量最高可达所感染细胞总蛋白量的50 %。(4) 表达产物具有活性:昆虫细胞对蛋白质表达后修饰加工的方式与哺乳动物细胞接近,能识别并正确地进行信号肽的切除及磷酸化、糖基化等反应,表达产物具有很高的生物活性,其抗原性、免疫原性均与天然蛋白相似。正是由于该表达系统具有的优点,目前已有病毒、细菌、真菌、动植物等多种生物基因在昆虫细胞或幼虫体内获得高表达。由于其可以容载大片段外源基因,可以使多个基因共表达,在疫苗研究中更具有优势,被认为是表达VL P 的最佳表达系统。因为单一成分所构成的亚单位疫苗常常有免疫原性弱的缺点,因此杆状病毒昆虫细胞表达系统已应用在多种疫苗研究中,尤以病毒疫苗为多。
二、相关的转化培养方法总汇
方法一：
昆虫细胞转染：
1．Sf9细胞计数，取6孔板中的两孔，每孔加入9×10 5个细胞(其中一孔设为正常对照)，并以全培培养至少1小时，使细胞贴壁。
2．准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物：
a.溶解1μg纯化重组杆状病毒重组质粒于100μl 无添加成分的Grace’s Medium。
b.转染试剂充分摇匀后取6μl加入100μl 无添加成分的Grace’s Medium，混匀。
c.将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温孵育20min。
3．重组质粒与转染剂混合液孵育的同时，以2ml无添加成分的Grace’s Medium洗涤待转染的一孔细胞并弃去洗液。
4．取0.8ml无添加成分的Grace’s Medium加入质粒与转染剂的混合液中，轻轻混匀后，总体积约为1ml。加入上步洗涤后的细胞孔中，27℃继续培养5h。
5．移除质粒、转染剂混合物，加入2ml全培。27℃湿盒孵育，直到病变现象产生。
二、病毒贮液的制备：
1.病毒感染晚期（正常24-72h）可见细胞停止生长、黏附，呈颗粒状外观。即收集含病毒的培养上清，500g离心5min，去除细胞和碎片。
2.上清即为P1病毒贮液，移入新的离心管中4℃避光保存。长期保存分装冻存于-80℃。
3.病毒贮液的扩增，按以下公式进行所需病毒P1贮液的量：
感染所需病毒贮液量(ml)=[MOI(pfu/cell) ×细胞数÷病毒贮液效价(pfu/ml)]
注：若不进行病毒空斑测定，P1贮液效价按照1×10 6到1×10 7计。
4.扩增P1液制备P2病毒贮液方法如下：
a.转染当天，取2×106个细胞/孔加入六孔板中，贴壁生长至少1h。
b.每孔加入适量的P1贮液，27℃湿盒孵育48h。
c.根均细胞病变情况（约48h后）收集各孔中的病毒上清液，500g离心5min取上清，即为P2病毒贮液。4℃避光保存。长期保存分装冻存于-80℃。
d.制备了高效价的P2液后，按上述方法扩增P3贮液，用于高效表达。
方法二：
1、病毒扩增
大量培养Sf9细胞，待细胞长成单层处于对数生长期时用于病毒感染。具体操作包括：吸弃培养基，接种病毒，使病毒感染复数(MOI)小于1。室温吸附1h后除去病毒接种物，换以新鲜培养基，27℃培养48～72h，收集上清待用。
2、表达产物的检测
病毒定量感染和样品制备　接种2×106个处于对数生长期的Sf9细胞至25cm2细胞培养瓶中，使用高滴度病毒原液，病毒滴度(PFU/mL)至少为1×108有效病毒粒子/mL，且病毒感染复数(MOI)控制在5～10之间。病毒接种细胞吸附1h后，弃病毒液，换以新鲜的培养基27℃培养72h后，移弃培养基，预冷的PBS(pH7.4)缓冲液洗涤细胞数次。除尽残留液体，再加入500μL预冷的细胞裂解液(含有1×Protease inhibitor cocktail)，用橡皮刮刮下细胞收集至eppendorf管内，置冰浴裂解45min，每50μL细胞裂解物分装至一个eppendorf管中，置于-20℃或者-80℃贮存备用或直接用于表达情况分析。
其它的不详细的方法
1.草地贪夜蛾( S podoptera f rugierda) Sf21 细胞系, E. coliDH5α,AcMNPV 1A 株,质粒pHZ402 ,pAcDZ1 均为本实验室保存,转座子构建质粒pMod2 购自Epicent re. Sf21 细胞用TNM2FH 培养液加10 %胎牛血清培养. 细菌、质粒、基因操作参照文献7 .
Sf21 细胞悬浮培养至约1 ×106 个时(参照文献8 ) ,按MOI = 1 pfu/ cell 接种AcMNPV ,48 h 后,细胞悬液以5 000 r/ min 离心15 min ,取上清液. 上清液再以17 000 r/ min 4 ℃离心30 min ,用450μL 无菌水悬浮沉淀. 加入50μL 10 %的SDS ,56 ℃30 min ;加入蛋白酶K至100μg/ mL , 再次56 ℃30 min. 用酚/ 氯仿法抽提病毒基因组DNA ,乙醇沉淀DNA. 以50μL 无菌水溶解DNA ,4 ℃放置待用
细胞转染
5 ×105 个Sf21 细胞27 ℃静置培养2 h ,使细胞贴壁. 取5μL 上述转座反应液,用Cellfectin ( Invit ro2gen) 转染细胞,方法参见产品说明书. 转染后细胞27 ℃培养,Nikon HFX倒置荧光显微镜观察. 转染后72h ,收集细胞的培养上清液,作为重组病毒库的原代病毒液,4 ℃保存备用.
2.参照Summers 的方法,重组转移载体pBacPAK2CE2 DNA 2μg 与线性化的病毒Bm2BacPAK6 DNA 500ng在脂质体的介导下共转染BmN 细胞(具体操作按Dosper 脂质体产品说明书进行) 。约4～7 d 细胞出现病毒感染症状,收集病毒液进行空斑筛选,挑斑于铺有单层BmN 细胞的96 孔板中,27 ℃条件下培养3～4 d ,用X2gal 挑选出白斑,再进行3 轮筛选以纯化重组病毒。
3.杆状病毒转移载体质粒PACSecG2T、sf9 细胞购自GIBCO BRL 公司,TNM2FH 昆虫细胞培养基、无血清昆虫细胞培养基、核多角体野病毒(ACNPV) DNA、磷酸钙共转染试剂合购自BD pharmingen 公司, 　重组病毒的构建[2～4 ] 　含有插入片段的重组质粒经纯化后与线性化的Baculo GOLDTM DNA ,采用磷酸钙介导的细胞转染法,经有限稀释法和空斑实验筛选重组病毒,具体操作见BD Pharmingen 公司手册,
表达产物的获得　将感染复数MOI 为7～10 的病毒加入处于对数生长期的sf9 细胞中,室温吸附2 h 后,用无血清培养基清洗2 次,再加入3 mL 新鲜的无血清培养基,28 ℃培养72～9 6 h ,收集细胞培养上清液。　重组蛋白的表达和特异性　以含病毒的上清液接种对数生长期的sf9 细胞,2 8 ℃培养3 d ,收获细胞,超声破碎,离心收集上清液电泳观察结果
4.选用美国Pharmigen 公司的磷酸钙共转染法将重组质粒导入Sf9 细胞,27 ℃培养5 d后,收获上清。将转染上清经噬斑纯化和扩增制备表达毒种,用Sf9 细胞或H5 细胞进行大量表达,MOI(感染指数,即每个细胞感染病毒的数量) 在3～10左右,27 ℃培养3～5 d 后,收获表达上清。
5.杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A , 线性化亲本AcMNPV 病毒Bac2N2blue DNA 为Invit rogen 公司产品。草地夜贪蛾Sf9 细胞由本室（中国科学院武汉病毒研究所）保存。同Insectin2plus Liposomes 脂质体及线性化亲本病毒Bac2N2blue DNA 共转染Sf9 细胞, 27 ℃培养5d。观察到典型的细胞病变特征后,收集细胞培养物上清液。将转染后上清液经系列稀释,感染贴壁良好的Sf9 细胞单层,然后以浓度为1. 25 %的低温琼脂糖Baculovirus Agarose 覆盖(含150μg/ mL X2gal) ,27 ℃培养7d 后挑取蓝色空斑。重组病毒感染Sf9 细胞,27 ℃培养96h 。将培养液于5 000g 离心5min ,PBS 洗涤沉淀3 次,细胞沉淀经细胞裂解液裂解(50mmol/ L Tris2HCl ,5 % 22巯基乙醇,0. 4 % SDS ,10mmol/ L EDTA) ,同时培养液上清经10 倍浓缩,分别上样进行SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot 分析检测CagA 的表达。
6.杆状病毒转移载体　pVL 1393, 本室（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室）保存。限制性内切酶及其修饰酶　购自P rom ega 和Cibco 公司。杆状病毒转染试剂盒Bac2N 2B lueTM 转染试剂盒购自Invit rogen 公司。
待Sf9 细胞感染rB2 病毒后60～ 72 小时收集细胞, 反复冻融三次, 再用超声波裂解五次, 每次一分钟[ 6 ]。取裂解产物
7. 重组病毒的获得用重组
质粒转染常规培养的123 细胞，具体操作参照转染试剂8.Sf9(Spodoptera fruiperda9) 昆虫细胞引自第四军医大学微生物教研室,在含有100ml/ L 胎牛血清及青、链霉素的TC - 100 培养液中27 ℃培养。野生型多角体病毒(AcMNPV) 购自Clontech 公司。杆状病毒表达载体pFBDHTa 和感受态菌DH10Bac ,均由第四军医大学微生物教研室惠赠。细胞转染试剂Lipofectamine TM2000 及超纯质粒提取试剂盒,购自Invitro2gen 公司。
转染Sf9 细胞　将Sf9 细胞培养在35mm
细胞培养板中,用脂质体法转染Sf9 细胞,具体方法参见LipofectAMINETM2000 试剂说明。转染后27 ℃培养过夜,次日换液,继续培养72～120h。收集培养上清,500g 离心10min ,上清为病毒原种, - 70 ℃保存。
　
毒种的纯化　　将收获的病毒上清用TC - 100 稀释,感染6 孔板中的Sf9 细胞,27 ℃孵育1h 后移出上清液,加入1ml 含1 %琼脂糖的TC - 100 培养基,待其凝固后加入1ml 含10 %FBS 的TC - 100 培养液于27 ℃孵育4～5d ,观察空斑形成。挑取单个空斑感染Sf9 细胞,27 ℃孵育3d 后分别收集细胞及感染上清,收集的感染上清即为纯化后病毒原种。
9.重组病毒的构建　取对数生长期的sf9细胞,接种于25 ml 培养瓶(1 ×106P瓶) ,共3 瓶,27 ℃培养5 h ;取6 支无菌小管,各加入100μl 无血清培养基,前3 管各加入1 μl Lipofectin ,混均,后3 管各加入5μl 、10μl 、15μl Bmhce DNA ,然后将Li2pofectin 管内含物分别加入含DNA 的3 个管中,转动管子以混均,27 ℃温育15 min ,取出后加入0. 8ml 无血清培养基、轻轻混均,然后轻轻加入到去掉上清的上述sf9 细胞层上,27 ℃培养5 h ,去上清,加入含血清培养基,置27 ℃培养,每天观察细胞病理变化。72～96 h 收取转染上清。空斑纯化重组病毒,测定感染上清的感染复数(MOI) [7 ] ;以1～10 个感染复数感染sf9 细胞,观察病理变化,于72～96 h 收取细胞和上清,细胞经PBS 洗后置- 20 ℃备用。
10. Sf29 细胞与A cN PV 病毒以及供重组用线形BaculoGoldTM DNA 均购自PharM ingen 公司。Sf29细胞置于含10% FCS 的TMN 2FH 培养基中(Sig2ma 公司) 在27 ℃条件下维系生长, 视生长情况进行传代。质粒DNA 共转染待Sf29 细胞于培养皿(60 mm ) 中长至50%～70%单层, 按操作手册进行pVL 1392 重组质粒与线形BaculoGoldTM DNA 共转染(BaculoGoldTM T rans2fection Kit, PharM ingen 公司) , 使之在Sf29 细胞内同源重组以获得含HPV 4 L 1 基因的重组杆状病毒。HPV4 L1 基因细胞内表达
待Sf29 细胞培养至对数生长期, 用上述重组杆状病毒感染细胞(MO I= 10) 并置27 ℃继续培养3d, 一部分细胞用于提取其总RNA (TR Izol 法, GIB2CO BRL ) , 经DN ase É 酶(Boeh ringerM annheim 公司) 处理后进行RT2PCR
分析, 逆转录引物选用T22(GIBCO BRL ) ; PCR 引物则根据HPV 4 L 1 基因序列进行设计, P1: A TGGAAACTGA GGGGAA TA G (nt 303→322) , P2: AAA GGTTCTGGTA GA GCATC (nt 827→808)。余下细胞部分用于SDS2PA GE凝胶(1215% ) 电泳, 并以0125% 考马斯亮蓝染色分析。