皮下注射抗PD-1纳米抗体抑制SFTSV在人源化小鼠中的复制

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南京大学吴稚伟课题组近日在EMBO发表了针对发热伴血小板减少综合症的单域抗体治疗的动物研究进展。发热伴血小板减少综合征（Severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS）是由新型布尼亚病毒（Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus， SFTSV）感染引发的新发蜱虫传染病， 2019年，国际病毒分类委员会将其更名为大别班达病毒（Dabie bandavirus，DBV）。主要临床表现包括高热、血小板减少、白细胞减少、出血和胃肠道症状及多器官功能障碍等，病死率为6-30%[ Xu M, Wang B, Deng F, Wang H, Wang M, Hu Z, Liu J (2021) Establishment of a Reverse Genetic System of Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus Based on a C4 Strain. Virologica Sinica 36: 958-967]。在过去的10年里，中国疾病预防控制中心报告SFTS发病率整体呈上升、扩散趋势，具有明显时空聚集性[ 陈秋兰，朱曼桐，陈宁（2022）2011-2021年全国发热伴血小板减少综合征流行特征分析. 中华流行病学杂志43(6): 852-859.]。迄今为止，尚无针对SFTS的有效疗法和疫苗，疾病发病机制仍不清楚。2018年，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）将SFTS列为危害公众健康的重要传染病之一，需要优先进行研究和干预。

免疫检查点分子，是免疫细胞上表达的受体，触发免疫抑制信号通路，并在维持自体耐受性和调节影响外周组织的免疫反应中起关键作用。程序性细胞死亡蛋白1（Programmed Cell Death Protein 1, PD-1）/程序性细胞死亡配体1（Programmed Cell Death Ligand-1, PD-L1）是一种重要的抑制性检查点信号通路，可抑制癌症和病毒感染的免疫反应[ Davar D, Dzutsev AK, McCulloch JA, Rodrigues RR, Chauvin J-M, Morrison RM, Deblasio RN, Menna C, Ding Q, Pagliano O et al (2021) Fecal microbiota transplant overcomes resistance to anti-PD-1 therapy in melanoma patients. Science 371: 595-602],[ Uldrick TS, Adams SV, Fromentin R, Roche M, Fling SP, Gonçalves PH, Lurain K, Ramaswami R, Wang C-CJ, Gorelick RJ et al (2022) Pembrolizumab induces HIV latency reversal in people living with HIV and cancer on antiretroviral therapy. Sci Transl Med 14: eabl3836]，其在丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）、人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus, HIV）等慢性病毒感染期间抑制免疫力的作用已经得到充分证实[ Jubel JM, Barbati ZR, Burger C, Wirtz DC, Schildberg FA (2020) The Role of PD-1 in Acute and Chronic Infection. Front Immunol 11: 487],[ Trautmann L, Janbazian L, Chomont N, Said EA, Gimmig S, Bessette B, Boulassel M-R, Delwart E, Sepulveda H, Balderas RS et al (2006) Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat Med 12: 1198-1202]。然而，PD-1/PD-L1在 SFTS 进展中的作用尚不清楚。

考虑到SFTSV的基因型多样性[ Fu Y, Li S, Zhang Z, Man S, Li X, Zhang W, Zhang C, Cheng X (2016) Phylogeographic analysis of severe fever with thrombocytopenia syndrome virus from Zhoushan Islands, China: implication for transmission across the ocean. Sci Rep 6: 19563]，缺乏特异性治疗药物以及病毒特异性免疫与存活率之间的相关性，本研究探索阻断PD-1/PD-L1通路是否可以抑制SFTSV复制并作为一种免疫治疗干预措施。首先，我们收集了2022年3月至7月来自南京大学附属鼓楼医院SFTS患者和健康志愿者的全血（各15例），采用密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞（PBMCs）；利用流式细胞术进行分析，结果揭示了SFTSV感染后免疫细胞上的PD-1/PD-L1表达升高。其次，为了进一步探索靶向PD-1的抗体是否可以抑制SFTSV复制，我们首先构建了一个来自免疫羊驼的抗PD-1蛋白的纳米抗体噬菌体文库，通过对PD-1蛋白VHH噬菌体文库进行多轮富集生物淘选，我们分离并自主制备出了高亲和力抗PD-1纳米抗体（NbP45），用于阻断PD-1/PD-L1通路。

体外功能实验揭示：与SFTSV（subtype E, JS-2013-24）病毒感染组相比，NbP45治疗组的病毒 RNA 拷贝数减少约1.0×107 拷贝数/ml，显著抑制了病毒的复制；此外，治疗组中CD8+/CD4+ T细胞的比例显著上调，annexin V+ 在CD4+/CD8+ T细胞中的表达明显下调，而CD4+ 或CD8+ T细胞中的 HLA-DR、Ki-67 或 IFN-γ 表达水平显著升高，表明抗体阻断PD-1/PD-L1通路后T淋巴细胞被激活。揭示了NbP45 有效减缓了T细胞的凋亡，促进其增殖，并抑制了SFTSV在PBMCs细胞中的复制。随后采用SFTSV亚型 D（20ZJTZ07）或 B（HB29）体外感染PBMCs细胞，结果显示NbP45同样显著抑制了病毒的复制，揭示了PD-1抗体的广谱性 (Figure 1)。




为了评估NbP45的体内疗效，我们采用具有人外周血单个核细胞的人源化 NCG 小鼠（NCG-HuPBL）模型，并建立了SFTSV （subtype E, JS-2013-24）感染的NCG-HuPBL小鼠模型[ Xu S, Jiang N, Nawaz W, Liu B, Zhang F, Liu Y, Wu X, Wu Z (2021) Infection of humanized mice with a novel phlebovirus presented pathogenic features of severe fever with thrombocytopenia syndrome. PLoS Pathog 17: e1009587]。随后，将NbP45通过腹腔（i.p.）或皮下（s.c.）注射的给药方式，在病毒感染后第1、3、5和7的特定时间进行治疗。体内实验分析结果显示：与感染组相比，NbP45采用皮下注射治疗第9天病毒RNA拷贝数减少约2个log10，第12和15天减少约1个log10，显著抑制了SFTSV在NCG-HuPBL小鼠中的复制；并且明显提高了血小板计数，揭示其预防病毒诱导的血小板减少症的能力。此外，采用皮下给药的NbP45治疗组显示人外周血单个核细胞中的CD8+/CD4+ T细胞比例显著增加，且体内血清NbP45抗体浓度下降缓慢。揭示了在NCG-HuPBL小鼠模型中，通过皮下注射NbP45可有效抑制SFTSV复制并缓解病毒诱导的血小板减少症 (Figure 2)。



综上所述，本研究显示PD-1在SFTSV急性感染治疗中的作用，可以作为治疗SFTSV的潜在免疫宿主靶点，并进行下一步干预措施的开发。而针对其他免疫检查点PD-L1、CTLA-4、CD47、TIGIT等抗体在SFTSV感染中的作用，需要进一步深入研究。此外，采用针对免疫检查点的抗体进行治疗具有几个独特的优势：（1）虽然SFTSV有6种不同的基因型和多种不同的血清型，但针对免疫检查点的治疗不容易受到不同基因型的影响;（2）靶向免疫检查点可以克服高度突变RNA病毒的内在性质;（3）通过激活免疫系统可以达到更有效的抑制和清除病毒的目的。
这项研究工作近日以Inhibition of SFTSV replication in humanized mice by a subcutaneously administrated anti-PD1 nanobody为题发表于EMBO-Molecular Medicine (https://doi.org/10.1038/s44321-024-00026-0)。论文共同第一作者吉萌萌和胡嘉倩分别为宁夏大学生命科学院和南京大学医学院博士生，南京大学附属鼓楼医院陈雨欣，宁夏大学生命科学院王玉炯，南京大学吴喜林和吴稚伟为共同通讯作者。本研究获得国家自然科学基金（National Science Foundation of China (NSFC)）(No. 32370988, 31970149 and U22A20335)，科技重大专项（2018ZX10301406）和南京大学-宁夏大学联合项目（Grant#2017BN04）的支持。
参考文献
Xu M, Wang B, Deng F, Wang H, Wang M, Hu Z, Liu J (2021) Establishment of a Reverse Genetic System of Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus Based on a C4 Strain. Virologica Sinica 36: 958-967
陈秋兰，朱曼桐，陈宁（2022）2011-2021年全国发热伴血小板减少综合征流行特征分析. 中华流行病学杂志43(6): 852-859.
Davar D, Dzutsev AK, McCulloch JA, Rodrigues RR, Chauvin J-M, Morrison RM, Deblasio RN, Menna C, Ding Q, Pagliano O et al (2021) Fecal microbiota transplant overcomes resistance to anti-PD-1 therapy in melanoma patients. Science 371: 595-602
Uldrick TS, Adams SV, Fromentin R, Roche M, Fling SP, Gonçalves PH, Lurain K, Ramaswami R, Wang C-CJ, Gorelick RJ et al (2022) Pembrolizumab induces HIV latency reversal in people living with HIV and cancer on antiretroviral therapy. Sci Transl Med 14: eabl3836
Jubel JM, Barbati ZR, Burger C, Wirtz DC, Schildberg FA (2020) The Role of PD-1 in Acute and Chronic Infection. Front Immunol 11: 487
Trautmann L, Janbazian L, Chomont N, Said EA, Gimmig S, Bessette B, Boulassel M-R, Delwart E, Sepulveda H, Balderas RS et al (2006) Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat Med 12: 1198-1202
Fu Y, Li S, Zhang Z, Man S, Li X, Zhang W, Zhang C, Cheng X (2016) Phylogeographic analysis of severe fever with thrombocytopenia syndrome virus from Zhoushan Islands, China: implication for transmission across the ocean. Sci Rep 6: 19563
Xu S, Jiang N, Nawaz W, Liu B, Zhang F, Liu Y, Wu X, Wu Z (2021) Infection of humanized mice with a novel phlebovirus presented pathogenic features of severe fever with thrombocytopenia syndrome. PLoS Pathog 17: e1009587