[转移贴]细菌染色标本检查方法之抗酸染色法—萋-尼抗酸...

cao1976

原贴Anthonybell 发表于 2010-3-22 13:51
http://biosky.haotui.com/thread-14113-1-3.html


（1）实验材料
①染色液。石炭酸复红液、碱性美蓝溶液、3%盐酸酒精。
②菌种。含结核分枝杆菌的痰标本。
③其他。普通玻片、酒精灯、接种环及显微镜等。
（2）实验方法
①涂片
a、直接涂片和厚膜涂片。用接种环挑取约0.01ml脓性或呈干酪样部分痰液，制成10mm*10mm大小的均匀薄涂片，或取上述标本约0.1ml，制成20mm*15mm大小的厚膜涂片。自然干燥，火焰固定后，行抗酸染色或金胺“0”荧光染色，镜检。
b、集菌涂片。І、沉淀集菌法。取痰液2—3ml，40g/lNaOH1—2倍量混匀。经103.43Pa高压灭菌20—25min（或煮30min），3000r/min离心30min，弃上清液，取沉淀物涂片做抗酸染色或金胺“0”荧光染色镜检；П、漂浮集菌法。取晨痰2—3ml放入100ml三角瓶内，加1—2倍量40g/lNaOH溶液，经103.43Pa高压灭菌20—25min（或煮30min）。冷却后滴加汽油0.3ml，瓶口盖玻璃纸加塞，塞紧瓶口，置振荡器或手摇振荡10min，再加蒸馏水至满瓶口而又不外溢，静置10—15min，将已编号的洁净载玻片盖在瓶口上，静置15—20min，取下载玻片并迅速将载玻片翻转至浸膜向上，或用接种环取瓶口液面物涂于载玻片上，自然干燥，火焰固定后做抗酸染色或金胺“0”荧光染色，镜检。
②染色
a、初染，在已固定的结核分枝杆菌痰标本涂片上放一小块滤纸片，之后滴加数滴石炭酸复红液后，将标本片放在火焰高处徐徐加温，当涂片上液体出现蒸汽时离开火焰（切不可煮沸），待玻片稍冷却后补充染液（以防干燥或玻片断裂 ），如此维持染色3—5min，待玻片冷却后用水冲洗，甩干。
b、脱色，在涂片上滴加数滴3%盐酸酒精，轻轻晃动玻片，直至无红色液体流下为止，一般作用1—3min，水洗，甩干。
c、复染，滴加数滴碱性美蓝液于涂片上，作用1min后，水洗，甩干。用吸水纸印干标本片或 自然干燥后油镜检查。
（3）结果判断和报告
结核分枝杆菌染成红色，菌体细长，有时微弯，呈分枝状排列，有时着色不均匀，呈颗粒状。非抗酸菌及标本中其他细胞均染成蓝色。
①直接涂片和厚膜涂片结果
—：仔细观察至少300视野未发现抗酸菌；
士：300个视野内发现1—2个抗酸菌（全部涂膜镜检3遍）；
+：100个视野内发现1—9个抗酸菌（全部涂膜镜检1遍）；
2+：10个视野内发现1—9个抗酸菌；
3+：每个视野内发现1—9个抗酸菌；
4+：每个视野内发现9个以上的抗酸菌。
②集菌涂片结果。按“发现抗酸染色 阳性细菌”或“未发现抗酸染色阳性细菌 ”报告。
（4）注意事项
①每张载玻片只允许涂1份标本，不得涂2份或2份以上标本，以免染色过程中菌体脱落而导致阴阳结果混淆。使用过的玻片要彻底清洗干净后才能再次使用，以防抗酸菌遗留在玻片上。
②抗酸染色时切勿使用染色缸。用于吸水的滤纸只能1片1张，不可重复使用。镜检时每检查 1份标本后，均需揩拭油镜头。滴加香柏油的玻璃棒或竹签不得触及玻片。
③抗酸染色时，脱色剂脱色时间宁长勿短，结核分枝杆菌脱色时间长至10—20min而不被脱色；而非抗酸菌则易脱色，故延长脱色时间有一定的鉴别作用。
④为了防止实验室感染，可先将待检的结核分枝杆菌标本高压灭菌后，涂片染色。这样既安全又不影响实验结果（此法仅用于大规模实验）。