2018年1月CRISPR/Cas亮点盘点

rentianyixu

基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一，受到人们的高度重视。CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称，Cas是CRISPR相关蛋白的简称。CRISPR/Cas最初是在细菌体内发现的，是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。

即将过去的1月份，有哪些重大的CRISPR/Cas研究或发现呢？小编梳理了一下这个月生物谷报道的CRISPR/Cas研究方面的新闻，供大家阅读。

1.Cell Stem Cell：利用CRISPR修饰表观基因组产生诱导性多能干细胞
doi:10.1016/j.stem.2017.12.001

在一项新的研究中，来自美国斯坦福大学、格拉斯通研究所和中国清华大学的研究人员报道，一种能够激活而不是切割DNA的CRISPR形式能够将胚胎小鼠细胞转化为诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell, ipsC）。相关研究结果于2018年1月18日在线发表在Cell Stem Cell期刊上，论文标题为“CRISPR-Based Chromatin Remodeling of the Endogenous Oct4 or Sox2 Locus Enables Reprogramming to Pluripotency”。

小鼠胚胎成纤维细胞，图片来自Bozonhiggsa/Wikimedia。

为了产生iPSC，科学家们过表达4种转录因子：Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc。但是，在这项新的研究中，这些研究人员利用一种表观遗传CRISPR技术激活仅一种转录因子---Sox2或者Oct4---的一个内源性基因拷贝，就将小鼠胚胎成纤维细胞转换为ipsC。

加州大学旧金山分校干细胞生物学家Sheng Ding和同事们使用了一种之前已发布的人工转录因子系统，该系统由一种经过修饰的没有核酸酶活性的Cas9（dCas9）和蛋白结合结构域组成。当与向导RNA（gRNA）结合在一起时，dCas9靶向一个特定的基因组位点，并且招募一种经过修饰结合到这些特定结构域（即蛋白结合结构域）上的转录激活蛋白（transcriptional activator protein），因此也必需将这种转录激活蛋白导入到这些细胞中。这些研究人员通过转染这种人工转录因子系统和18种gRNA（靶向与这4种传统的转录因子和另外3种其他的多能性转录因子相关的一系列增强子和启动子位点）到小鼠胚胎成纤维细胞中，成功地产生了ipsC。

2.Science：发现10种新型细菌免疫防御系统，有望开发出下一代基因编辑工具
doi:10.1126/science.aar4120

直到十年前，科学家们还没有意识到细菌具有复杂的免疫系统，即能够跟上感染细菌的病毒（即噬菌体）进化速度的免疫系统。随着发现一种如今最为知名的被称作CRISPR的细菌免疫机制以后，情况发生了变化。科学家们已意识到CRISPR是一种天然的基因编辑器，而且它已在世界各地数以千计的实验室中引发生物学研究领域变革。如今，研究人员理解到大多数微生物具有复杂的免疫系统，而CRISPR仅是其中的一个组分；但是没有一种很好的方法来鉴定这些系统。

在一项大规模的系统性研究中，来自以色列魏茨曼科学研究所的Rotem Sorek教授和他的研究团队揭示出细菌存在10种之前未知的细菌免疫防御机制。Sorek说：“我们发现的这些系统不同于之前看到的。但是，我们认为在这些系统中，有一到两种系统可能有潜力扩大基因编辑工具箱，而其他的系统指向人体免疫系统的起源。”相关研究成果于2018年1月25日在线发表在Science期刊上，论文标题为“Systematic discovery of antiphage defense systems in the microbial pangenome”。

Sorek说，“我们成功地找到10种新型细菌防御系统的事实意味着存在更多的细菌防御系统。 我的实验室正在继续寻找新的防御系统，另外，我们正在开始关注几种更有前景的防御系统以便理解它们如何发挥功能。”

3.美国计划利用CRISPR开展治疗致命性肿瘤的人体临床试验
新闻来源：CRISPR to Debut in Clinical Trials

美国首个涉及基因编辑工具CRISPR的人体试验可能随时会开始，它将采用这种DNA切割技术来抵抗致命性的癌症。

图片来自greenvector/istock。

美国宾夕法尼亚大学的医生们说，根据本周计划发布的正在进行的临床试验目录，他们将使用CRISPR来对人体免疫细胞进行修饰，使得它们成为老练的癌症杀手。

这项临床研究将招募多达18名患有三种不同类型的癌症---多发性骨髓瘤、肉瘤和黑色素瘤---的患者。这些患者可能成为中国之外的第一批在医学上使用CRISPR的人，而在中国，类似的研究已在开展中。

今年晚些时候可能在欧洲开始的第二项CRISPR临床试验也将采用这种体外基因疗法。作为一家位于美国马萨诸塞州剑桥市的生物技术公司，CRISPR治疗公司（CRISPR Therapeutics）在2017年12月请求了欧洲监管部门允许它通过对患者的血细胞进行基因编辑来尝试治疗一种被称作β地中海贫血的血液疾病。

4.布罗德研究所遭受重大挫折！在欧洲的一件CRISPR技术基础专利惨被撤销
新闻来源：EPO Revokes Broad’s CRISPR Patent
在排除关于CRISPR基因编辑技术的一件基础专利的最早优先权日后不久，欧洲专利局（EPO）在2018年1月17日上午完全撤销了这件专利，而且更多的专利也可能面临类似的命运。

在EPO裁定这件基础专利被撤销之后，布罗德研究所正在面临着它在欧洲丧失在涉及CRISPR基因编辑技术的知识产权上的主导地位。这件基础专利被撤销是因为对EPO来说，布罗德研究所并没有满足确定它的研究人员是首次在真核生物中使用CRISPR的要求。

除了布罗德研究所和加州大学在美国针对CRISPR基因编辑的权利存在高度公开的专利纠纷之外，布罗德研究所一直在欧洲争取维持它的多件涉及这种基因编辑技术的专利。这一纠纷围绕着布罗德研究所和洛克菲勒大学之间的一个分歧，即谁应当被署名为发明人。布罗德研究所在欧洲提交的大部分专利申请都没有署名洛克菲勒大学和洛克菲勒大学研究员Luciano Marraffini为发明人，不过这两者仅在提交的几份专利申请文件中被署名，这几份专利申请文件确定了这件基础专利的最早优先权日为2012年12月。改变专利申请文件中记录的发明人违背了EPO对优先权的形式要求（formal requirements），从而导致EPO裁决这些具有完整发明人清单的专利申请文件不应被用来确定具有更多限制的欧洲专利申请的优先权。

Coombes解释道，“如果你的用于确定优先权的专利申请文件中有一个以上的人署名，那么他们是一个单一的法律统一体。如果你打算减少发明人的数量，那么你首先需要转移来自每名发明人的优先权。” 她补充道，鉴于布罗德研究所和洛克菲勒大学之间正在进行的仲裁，一点都不奇怪的是，布罗德研究所并没有获得这种转移。

5.Plant Biotechnol J：构建出猕猴桃多重高效基因组编辑系统
doi:10.1111/pbi.12884

在一项新的研究中，来自中科院华南植物园的研究人员构开发出一种快速高效的成对sgRNA的Cas9双元表达载体构建策略。这种策略仅需合成两种含sgRNA的引物，从而大幅降低成本，而且在猕猴桃中的基因编辑效率增加将近10倍。相关研究结果于2018年1月13日在线发表在Plant Biotechnology Journal期刊上，论文标题为“Optimized paired-sgRNA/Cas9 cloning and expression cassette triggers high-efficiency multiplex genome editing in kiwifruit”。

6.Science：基因疗法进入成熟阶段
doi:10.1126/science.aan4672

经过三十年挫折的磨砺，基因疗法（通过修改人的DNA来治疗疾病的过程）不再是医学上的未来事情，而是当前临床治疗工具包的一部分。 2018年1月12日，发表在Science期刊上的一篇标题为“Gene therapy comes of age”的论文深入地且及时地回顾了导致开发出几种成功地治疗严重疾病患者的基因疗法的关键进展。

图片来自Science, doi:10.1126/science.aan4672。

美国国家卫生研究院（NIH）下属的国家心脏、肺部与血液研究所（NHLBI）血液部门高级研究员Cynthia E. Dunbar博士为这篇论文的共同通信作者。这篇论文也讨论了新兴的基因组编辑技术。根据Dunbar和她的同事们的说法，包括CRISPR/Cas9在内的这些方法将为精准地校正或改变个人基因组提供方法，这应该会转化为更加广泛的和更加有效的基因疗法。

这些作者们着重关注迄今为止在基因治疗方面已取得最好结果的方法：1）直接在体内给予病毒载体或者使用病毒，将治疗性基因运送到人细胞中；2）在实验室中对来自一名患者的造血干细胞或骨髓干细胞进行修饰，随后将这些经过基因改造的细胞注射回这名患者体内。

在2017年，源源不断的鼓舞人心的临床结果表明治疗血友病、镰状细胞病、失明、几种严重遗传性神经退行性疾病、一系列其他的遗传疾病和多种骨髓和淋巴结癌症的基因疗法取得了进展。

7.Cell Res：我国科学家首次利用CRISPR获得基因敲入的食蟹猴
doi:10.1038/cr.2018.9

在一项新的研究中，来自中科院神经科学研究所等研究机构的研究人员利用一种基于CRISPR/Cas9的同源介导末端连接（Homology-Mediated End Joining, HMEJ）策略，通过一细胞胚胎注射首次成功地获得了基因敲入的食蟹猴。相关研究结果于2018年1月12日在线发表在Cell Research期刊上，论文标题为“Generation of knock-in cynomolgus monkey via CRISPR/Cas9 editing”。

8.Nature：号外！人免疫系统可能会破坏一些CRISPR基因疗法
新闻来源：How the immune system could stymie some CRISPR gene therapies

根据2018年1月5日发布的一项新的研究，人体自身的免疫系统可能阻止一些基于流行的基因组编辑工具CRISPR-Cas9开发基因疗法的努力。CRISPR-Cas9有朝一日可能用于人体中校正致病性突变的希望是巨大的。但是，这项发表在预印本服务器bioRxiv上但迄今为止尚未得到同行评审的新研究针对这种方法是否会取得成功提出了质疑。

图片来自Bryan Satalino。

由美国斯坦福大学儿科血液学家Matthew Porteus和Kenneth Weinberg领导的一个研究团队分析了22名婴儿和12名健康成年人的血液样品以便确定这些人是否对这两种最常用的Cas9酶版本产生免疫反应。

他们发现79％的研究参与者对来自金黄色葡萄球菌（Staphlococcus aureus）的Cas9酶（即SaCas9）产生抗体， 65％的研究参与者对来自酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的Cas9酶（SpCas9）产生抗体。

在一项相关的实验中，在13名成人参与者中，有46％的人产生靶向SaCas9的T细胞（一种免疫细胞），但是在这13人中，并没有发现靶向SpCas9的T细胞反应，不过这些研究人员承认他们的测试方法可能没有足够的灵敏度来检测它们。