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【文献阅读】CRISPR,从基因魔剪到病毒检测,附文献全文

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发表于 2018-5-19 10:39:41 | 显示全部楼层 |阅读模式
导 读
       利用CRISPR技术中两个Cas蛋白可结合于特定的目标序列的特点,建立了新型病毒检测技术,通过基因编辑技术进行病毒检测具有经济、简便且高灵敏的优点。近日,杜克大学生物医学工程系和基因组及计算生物学中心的Dewran Kocak 和 Charles A. Gersbach发表专栏文章“From CRISPR scissors to virus sensors”,并刊发于国际著名期刊Nature杂志



背景介绍

      病毒感染者的病毒载量多数情况下较低,如在寨卡病毒爆发时,感染个体的血液中病毒量仅为1个copy/μl。如此低的病毒拷贝数给临床诊断带来很大限制。Science杂志曾分别报道了3个研究小组的基于基因编辑技术病毒检测技术。

        CRISPR 系统,来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes),已被改良为一个基因编辑工具,它正在变革传统的生物医学研究。不同种类的CRISPR系统,都有其特定的特征。本文的涉及的三个研究团队所使用CRISPR系统虽各有特点但也有共性:宿主基因组中整合有感染的病毒基因。当病毒再次感染时, Cas 酶活性启动,并可结合并裂解目标核酸序列(collateral activity)。由此利用这个活动作为一个检测信号放大器和检测分子信标( Beacon )。

第一篇研究论文
       Chen等研究建立了基于Cas12a蛋白的V型CRISPR系统。研究发现了Cas12a在结合于它特异的双链DNA目标之后,可任意地劈开单链DNA(collateral activity)。由此建立了可用于检测DNA病毒的一个诊断的工具。
Cas12a向导序列被设计用于匹配病毒DNA上的特殊目标。在结合于一个病毒的目标后,Cas12a切开“报告基因”(一个末端被一个荧光分子标记,另一端被一个淬火分子标记的一个单链DNA分子)。切开之前,荧光基团发出的荧光被淬火分子捕获。然而,在单链DNA被Cas12a切开后,荧光可以很容易地检测到(图a)。
为提高荧光检测信号的灵敏度,研究团队借助重组酶聚合酶扩增(RPA)技术扩增目标病毒DNA,如此可比在最初的标本中产生更多的目标拷贝。


第二篇研究论文
        Gootenberg 等将先前的工作扩展,创造了一个称为SHERLOCKv2 的诊断法(specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking version 2) 。SHERLOCK最初的版本,与Chen的研究相似,但使用Cas13,它可结合并酶切RNA,而不是DNA[5],SHERLOCK 并不局限于RNA检测,因为可在RPA过程中,加入一个转录步骤,使得病毒的DNA转为RNA[6]。
Gootenberg 团队从几个方面改进了SHERLOCK。如,他们筛查17个Cas13家族成员,全面解析其活性,并通过使用4个不同Cas13蛋白,创新性建立了可以同时检测四种病毒的SHERLOCKv2系统,灵敏度可达每毫升样本2病毒基因组拷贝。研究者还发现Cas13的分裂产物可以激活另一个Cas蛋白——Csm6。通过包含一个附加的单链RNA构造,它能被活化的Csm6劈开(图1.b)。
研究组提高了与背景有关的信号,且改进了SHERLOCKv2反应的动力学。最后,作者们组合这些结果开发出一个更为简便的试验:将一滴样本保存一张试纸上即可后续检测,如此可便于临床的扩大应用。


图1:利用CRISPR-Cas进行病毒检测原理图

第三篇研究论文
       由Chen等和Gootenberg 等研发的技术都要求严格的纯化步骤,来预防病毒被身体的RNA消化酶在实验中降解。而在该篇论文中,Myhrvold等综合先前报道的SHERLOCK版本和引入采取酶失活技术,如此可直接在尿和唾液中检测病毒。
病毒的基因组能快速地变异,但是Myhrvol研究组声称可以其方法可以区别相差一个单独核苷酸变异的序列。如,可以用其方法鉴定分离于不同地理区域的寨卡病毒毒株,以及携带与头小畸形有关的一个突变的寨卡病毒。整个实验流程可在2小时内完成,且对设备和样品的标准要求较低。


结 语
CRISPR技术的兴起,目前主要集中于它在基因或细胞治疗上的使用,但费用昂贵的,在可预知的将来,也许只能在世界的富裕地区得到使用。而当前的研究,简便、经济、实用,如此将极大地使CRISPR技术的可能受益者扩大和多样化。

DOI
  10.1038/d41586-018-04975-8
文献全文可点击下面的阅读原文获取

相关文献

1. Lanciotti, R. S. et al. Emerg. Infect. Dis. 14, 1232–1239 (2008).
2. Chen, J. S. et al. Science 360, 436–439 (2018).
3. Gootenberg, J. S. et al. Science 360, 439–444 (2018).
4. Myhrvold, C. et al. Science 360, 444–448 (2018).
5. Abudayyeh, O. O. et al. Science 353, aaf5573 (2016).
6. Gootenberg, J. S. et al. Science 356, 438–442 (2017).
7. East-Seletsky, A. et al. Nature 538, 270–273 (2016).
8. Kosack, C. S., Page, A.-L. & Klatser, P. R. Bull. Wld Health Organ. 95, 639–645 (2017).

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 楼主| 发表于 2018-5-19 11:21:08 | 显示全部楼层
本帖最后由 hantavirus 于 2018-5-19 11:25 编辑

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