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[求助] [转移贴]想向各位前辈请教一下关于PCR产物纯化与测序问题

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发表于 2015-7-20 12:10:50 | 只看该作者 回帖奖励 |倒序浏览 |阅读模式
原贴由minister发表于 2009-8-29 10:20
http://biosky.haotui.com/thread-11511-1-7.html

想向各位前辈请教一下关于PCR产物纯化与测序问题。

我看到了有两个方案:

1.PCR扩增产物经过电泳,割胶后使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行DNA回收纯化,送至华大基因测序。

2.扩增产物回收纯化后与PMD-18T载体连接,筛选阳性克隆,经过双酶切鉴定后进行序列测定。

我的PCR产物就单一的一条带,大约500bp吧,先用的是方案1,华大测序结果正常,但是我想问一下为什么很多人发PAPER都写方案2啊?

为什么呢?:~)有什么好处呢?

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 楼主| 发表于 2015-7-20 12:12:28 | 只看该作者
jbclinnic 发表于 2009-8-29 11:39 :
扩增片段一样,但是很可能存在变异
比如,很多病毒是混合侵染,得到的PCR产物就是多态性混合的产物
直接回收不能避免此类情况。

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 楼主| 发表于 2015-7-20 12:12:59 | 只看该作者
wjg_1979 发表于 2009-8-29 12:13 :

两种方案:一种是用克隆载体的,另一种是不用克隆载体的.两种有什么区别呢?
区别在于不用载体的是直接用PCR产物测序,这种是用PCR扩增引物来测序,通常这样的测序结果前100 nt是不准确的或是不可靠的,同时,这样还会另一个问题就是测不出结果,因为测序引物的要求较PCR扩增引物要高些.除非是你要的序列不包括前100-150nt序列,否则,不建议直接用PCR产物测序.而连接上载体后可克服这些问题.另外,克隆质粒易于保存,以便以后用得着,而PCR产物保存较易降解.结上所述,Paper中都是用作者所说的第二种方案.

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 楼主| 发表于 2015-7-20 12:13:35 | 只看该作者
123qsz321发表于 2009-8-30 11:12 :
PMD-18T载体连接以后 这种带有目的片段的质粒可以保存 并且可以为后续试验提供保障 例如 你要做目的片段的蛋白表达 前期的工作就是验证你的片段得到测序结果 确保没有突变  为下一步表达载体的构建提供保障 因为PMD-18T载体是比较便宜  购买的较好的表达载体是有点贵 所以需要前期的验证和保障试验的顺利  说的有点啰嗦 本人陋见

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 楼主| 发表于 2015-7-20 12:14:29 | 只看该作者
stare024 发表于 2009-8-30 12:36 :
同意楼上。克隆到载体上便于以后的实验操作。
克隆到质粒上便于保存,以后想再用这个片段的话,直接扩增质粒用质粒上的酶切位点切下即可。
对于一些酶切位点少的片段,也可以在后续的实验中采用质粒上不同的酶切位点切得所要的片段,连接不同的载体。
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