叶绿素，SOD,MDA,POD,硝酸还原酶等测定方法

jbclinnic

1 叶绿素含量测定：

80％的丙酮液的配制：4L丙酮 + 1L蒸馏水。

称0.5g左右的叶片放在50ml的离心管（做三个重复），加入25ml浓度为80％的丙酮液，放在黑暗处浸提大约36小时后取出，稀释4倍后分别在波长663nm、645nm、652nm和470nm下测定光密度，以80％的丙酮液为空白。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P35～36）

也可用95%乙醇溶液，在665、649、470nm处有最大吸收峰

Ca=13.95D665-6.88D649

Cb=24.96D649-7.32D665

Cx.c=(1000D470-2.05Ca-114Cb)/245



2 抗氧化酶活性的定：（2.5g样）

0.05mol/L磷酸缓冲溶液 (PBS)（pH=7.8）溶液的配制：65.5506g Na2HPO4·12H2O + 2.65285g NaH2PO4·2H2O, 定容到4L。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P134）。

取低温保存的鲜样，称2g左右的叶片（或根）放在50ml的离心管，加入20ml浓度为0.05mol/L磷酸缓冲溶液（pH=7.8）（最好是较冷的磷酸缓冲溶液，防止研磨时温度过高使酶失活），研磨（用磨碎机磨），8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟，上清液为粗酶液。



2.1丙二醛（MDA）的测定：

20％三氯乙酸（TCA）溶液的配制：称200g三氯乙酸，用蒸馏水定容到1000ml。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124）；

0.5% 硫代巴比妥酸（TBA）溶液的配制：称5g硫代巴比妥酸（TBA）,用20％三氯乙酸（TCA）溶液溶解并定容到1000ml。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124）（先加少量的氢氧化钠1mol/L溶解）；

0.5ml酶液（对照用0.5ml的0.05mol/L pH=7.8的磷酸缓冲液代替酶液）（做三个重复）+ 3mlTBA――振荡――沸水浴上反应30min――冷却（至少30min）――比色（OD600、OD532、OD450）。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P124）



2.2超氧化物歧化酶（SOD）的测定：

NBT(400ml)混合反应液:

392mlPBS(Ph=7.8),+0.0206g NBT+ 0.776g甲硫酸铵+8ml核黄素溶液+0.4ml EDTA-Na溶液

（100mlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄素）。

（另配）100ml PBS溶液加EDTA-Na 3.7224gEDTA-Na

测试时：取3ml反应液+0.05ml(根)或0.02 ml(叶)粗酶液，于光照培养箱中6-10分钟，OD650下测定吸光度。











2.3过氧化物酶（POD）的测定：

0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)（pH=7.0）溶液的配制：10.9251g Na2HPO4·12H2O + 3.042975g NaH2PO4·2H2O,定容到1000ml。

0.3%H2O2溶液的配制：吸2.5ml 30%H2O2，用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。

0.2%愈创木酚溶液的配制：称0.5g愈创木酚，用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。

2ml 0.3%H2O2溶液 + 0.95ml 0.2%愈创木酚溶液 + 1ml 0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS) + 0.02ml？？（原来为0.01）酶液（根加0.05ml酶液）（对照用0.05mol/L磷酸缓冲溶液代替酶液）（做三个重复），记录470nm处OD降低速度。将每分钟OD增加0.01定义为1个活力单位。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P121）

比色时加酶液，混合后即刻计时。

2.4 脯氨酸的测定

标准曲线的制作：

编号
1
2
3
4
5
6
7

标准脯氨酸的量（ml）
0
0.1
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0

H2O（ml）
1.0
0.9
0.8
0.6
0.4
0.2
0

冰乙酸（ml）
2
2
2
2
2
2
2

显色液（ml）
3
3
3
3
3
3
3

脯氨酸含量（µl）
0
1
2
4
6
8
10


    0.5ml酶液（对照用0.5ml 80％乙醇代替）（做三个重复） + 1ml冰乙酸 + 1.5ml显色液―――混匀，沸水浴15min，冷却后测OD520。



2.5可溶性蛋白的测定（参考赵志杰，史国安，董新纯编的《植物生理学实验指导》）

牛血清白蛋白：配成100µg/ml和1000µg/ml。

90％乙醇：90ml乙醇 + 10ml蒸馏水。？？？

85％（W/V）磷酸：170ml磷酸 + 30ml蒸馏水。

考马斯亮蓝G-250:称0.2g考马斯亮蓝G-250溶于100ml 90％乙醇中，加入85％（W/V）磷酸200ml，用蒸馏水定容到2L。常温下可保存一个月。

标准曲线的制作：

配制0～100µg/ml血清白蛋白血液

管号
1
2
3
4
5
6

100µg/ml牛血清白蛋白(ml)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0

蒸馏水量(ml)
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0

蛋白质含量（ml）
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10


配制0～1000µg/ml血清白蛋白血液

管号
7
8
9
10
11
12

100µg/ml牛血清白蛋白(ml)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0

蒸馏水量(ml)
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0

蛋白质含量（ml）
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0


0.1ml 酶液（做三个重复） + 5ml考马斯亮蓝G-250―――混匀，放置2min后在595nm下比色。



2.6过氧化氢酶（CAT）的测定：

0.3%H2O2溶液的配制：吸5ml 30%H2O2，用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到500ml。

1 ml 0.3%H2O2溶液 + 1.9ml H2O + 0.1 ml 酶液，测定240nm处OD降低速度。将每分钟OD减少0.01定义为1个活力单位。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P121）



2.7 抗坏血酸（ASA）的测定：（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P125）

5％ 三氯乙酸（TCA）溶液的配制：25g三氯乙酸，用蒸馏水定容到500ml。

10％ 三氯乙酸（TCA）溶液的配制：25g三氯乙酸，用蒸馏水定容到250ml。

150mmol/L NaH2PO4（pH 7.4）溶液的配制：100ml。

44％ H3PO4溶液的配制：250ml。

4％ 2,2-二联吡啶溶液的配制：250ml。

3％ FeCl3溶液的配制：100ml。

首先标制作准曲线。

粗酶液的提取：取低温保存的鲜样，称0.5g左右的叶片（或根）放在50ml的离心管，加入15m  5％三氯乙酸（TCA）溶液（最好是较冷的三氯乙酸（TCA）溶液，防止研磨时温度过高使酶失活），研磨（用磨碎机磨），15000r/min的冷冻离心机下离心10分钟，上清液为粗酶液，用于抗坏血酸（ASA）含量的测定。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P125～126）

测定：0.2ml 粗酶液 + 0.2ml 150mmol/L NaH2PO4（pH 7.4）溶液 + 0.2ml H2O，混匀（振荡），至少30秒后，再依次分别加入：0.4 ml 10％三氯乙酸（TCA）溶液 + 0.4 ml 44％ H3PO4溶液 + 0.4 ml 4％ 2,2-二联吡啶溶液 + 0.2ml 3％ FeCl3溶液，混合后在37℃水浴中保温60min，测定OD525处的值。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P125～126）



2.8 谷胱甘肽的测定：

4g新鲜材料 + 2ml 0.3mol/L醋酸汞 + 2ml 30％醋酸钠后研磨匀浆，转移到离心管中，以蒸馏水冲洗残渣，并以玻璃棒搅拌，净置10min，使之充分沉淀，离心后弃去上清液，沉淀以水（每次10ml）在摇动情况下冲洗2次。向沉淀中加入10ml 1mol/L盐酸以溶解其中的谷胱甘肽，以玻璃棒搅拌5min后加入1ml 20％的碘化钾溶液，混匀，离心。上清液转入供滴定用的100ml玻璃管中，沉淀在搅动情况下以10ml水冲洗。离心后溶液与第一次离心液合并。向得到的溶液中加入0.5ml淀粉液，用1mmol/L KIO3滴定，直至出现不消失的蓝色为止。1ml 1 mmol/L 的KIO3相当于0.307mg谷胱甘肽。（参考《现代植物生理学实验指南》，中国科学院上海植物生理研究所编）。



2.9天冬酰胺合成酶（AS）的测定：





2.10 天冬酰胺转氨酶（AspAT）的测定：





3 硝酸还原酶(NR)的测定采用离体法：（1g样）（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P27～29）

亚硝酸钠标准溶液（1µg/ml）：称NaNO2 0.9857g ,定容到1000ml，再吸5ml定容到1000ml。

0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液：30.0905g Na2HPO4·12H2O + 2.4965g NaH2PO4·2H2O，加蒸馏水定容到1000ml。

3mol/L HCl：125ml浓盐酸加蒸馏水定容到500ml。

1％ 磺胺溶液：5.0g磺胺溶于500ml 3mol/L HCl中。

0.2％ a-萘胺溶液：1.0g a-萘胺溶于125ml冰醋酸后用蒸馏水定容到500ml，贮于棕色瓶中。

0.1mol/L KNO3溶液：5.055g KNO3溶于500mln 0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液。

0.025mol/L pH8.7的磷酸缓冲溶液：Na2HPO4·12H2O 8.8640g + NaH2PO4·2H2O 0.0570g，加蒸馏水定容到1L。

提取缓冲液：1.211g半胱氨酸 + 0.372g EDTA，溶于1L 0.025 mol/L pH8.7的磷酸缓冲溶液。

2mg/ml NADH 溶液：0.5g NADH溶于250ml 0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液（临用前配制）。

首先标制作准曲线:

取7支洁净烘干的15ml刻度试管加试剂，即配成0～2.0μg的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在30℃保温箱或恒温水浴中保温30min，然后在540nm波长下比色。以亚硝态氮（μg）为横坐标（x），光密度值为纵坐标（y）绘标准曲线或建立回归方程。

各试剂加入顺序

管  号
1
2
3
4
5
6
7

亚硝酸钠标准液(ml)
0
0.2
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0

蒸馏水(ml)
2.0
1.8
1.6
1.2
0.8
0.4
0

1％ 磺胺溶液(ml)
4
4
4
4
4
4
4

0.2%α-萘胺(ml)
4
4
4
4
4
4
4

每管含NO2- (μg)
0
0.2
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0


1g 材料+15ml提取缓冲液后研磨匀浆，转移到离心管中于4℃、4000r/min下离心15min,上清液即为粗酶提取液，用于硝酸还原酶(NR)的测定。

0.4ml+1.2ml 0.1mol/L KNO3溶液 + 0.4mlNADH溶液后混匀（对照不加NADH溶液，而以0.4ml 0.1mol/L pH 7.5磷酸缓冲液代替），在25℃水浴中保温30min。保温结束后立即加入1ml磺胺溶液终止酶反应，再加1ml 0.2％ a-萘胺溶液，显色反应15min后于4000r/min下离心5min，取上清液在540nm下比色测定吸光度。根据回归方程计算。