设为首页收藏本站

中国病毒学论坛|我们一直在坚持!

 找回密码
 立即注册

QQ登录

只需一步,快速开始

搜索
热搜: 活动 交友 discuz
查看: 2473|回复: 0
打印 上一主题 下一主题

[资源共享] [转移贴]Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞

[复制链接]

2360

帖子

1831

学分

10万

金币

管理员

Rank: 9Rank: 9Rank: 9Rank: 9

积分
1831
QQ
跳转到指定楼层
楼主
发表于 2015-7-30 16:10:40 | 只看该作者 回帖奖励 |倒序浏览 |阅读模式
原贴由WIZARD 发表于 2008-4-1 18:31

测定细胞免疫功能首先要从人或动物外周血或组织中获取有活性的细胞,如淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞等。取得有活性的细胞应根据不同目的,采用不同方法,考虑(1)细胞纯度;(2)细胞获得量;(3)细胞活力;(4)使用方法的简易程度和本室条件等。目前常用Ficoll密度梯度离心法直接分离和纯化外周血单个核细胞。
  (一) 原理:
  常用来分离人外周血单个核细胞(PBMC)的分层液比重是 1.077±0.001 的 聚 蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F/H)分层液。Ficoll是蔗糖的多聚体,呈中性,犌W水性高,平均分子量为400,000,当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大,离心后沉于管底;淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重,离心后漂浮于分层液的液面上,也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞,就可从外周血中分离到单个核细胞。
  (二) 方法:
  1. 在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。
  2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液或RPMI1640充分混匀,用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上,注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。
  3. 离心后管内分为三层,上层为血浆和Hank's液,下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液,在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带(如下图),单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外,还含有血小板。

  4. 用毛细血管插到云雾层,吸取单个核细胞。置入另一短中管中,加入5倍以上体积的Hank's液或RPMI1640,1500rpm×10分钟,洗涤细胞两次。
  5. 末次离心后,弃上清,加入含有10%小牛血清的RPMI1640,重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2%台盼兰染液混合,于血球计数板上,计数四个大方格内的细胞总数。
  单个核细胞浓度(细胞数/1毫升细胞悬液)=
         4个大方格内细胞总数
         ────────── × 104×2(稀释倍数)
              4
  6. 细胞活力检测:死的细胞可被染成兰色,活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。
             活细胞数
     活细胞百分率=────── ×100%
             总细胞数
  用本法分离PBMC,纯度在90%以上,收获率可达80~90%,活细胞百分率在95%以上。  

(三) 试剂和材料:
  比重1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺(商品名为淋巴细胞分离液)。
  Hank's液(无Ca2+、Mg2+)
  10%小牛血清RPMI1640
  0.2%台酚兰染色液,用生理盐水或等渗的PBS配制。
  肝素用Hank's液或生理盐水稀释成500单位/ml,牽9凝人外周血肝素用量约为50单位/1毫升血。
  短中管、毛细滴管、1毫升和10毫升刻度吸管。
  无菌干燥注射器针头。
  碘酒,75%酒精,无菌棉球,镊子,橡皮止血带。
  血球计数板、显微镜、水平式离心机。
  (四) 注意事项:
  1. 抽取人外周静脉血时要注意无菌操作。
  2. 操作全程应尽可能短时间内完成,以免增加死细胞数。
  3. 用淋巴细胞分离液分离PBMC时,离心机转速的增加和减少要均匀、平稳,使保持清晰的界面。
  4. 小鼠、兔等动物淋巴细胞比重与人不同,犛&配制相应密度的Percoll或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。
  (五) 附录
  1. Hank's液(无Ca2+、Mg2+)配制法
    NaCl 8.0克
    KCl 0.4克

    Na2HPO4·12H2O 0.12克
    KH2HPO4         0.06克
    葡萄糖          1.0克
    双蒸水          1000毫克
    1%酚红液          2毫克

  将上列成分混合后溶化,分装于500毫升盐水瓶内,8磅15分钟灭菌,4℃冰箱保存,临用时调PH至7.3~7.6。
  2. 细胞分层液配制法
    9%聚蔗糖         24份
    34%泛影葡胺        10%
  混合,测比重为1.077~1.078,G5玻璃滤器过滤除菌。4℃冰箱保存备用。
  3. 磷酸缓冲液(P
  原液:
  A液: 0.2M NaH2PO4溶液
     NaH2PO4           27.6克
     或NaH2PO4·2H2O       31.2克
     蒸馏水 溶解至        1000毫升
  B液:0.2M Ha2HPO4溶液
     Ha2HPO4·12H2O       71.6克
     蒸馏水溶解至1000毫升
  各种不同PH值PB的配法
───────────────────────────────────────
 PH     7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0
───────────────────────────────────────
A液(ml) 39.0 28.0 19.0 13.0 8.5 5.5
B液(ml) 61.0 72.0 81.0 87.0 91.0 94.5
───────────────────────────────────────
  举例:  0.1M  PH7.2PB
      A液   28毫升
      B液   72毫升
     加蒸馏水  100ml
  4. 血球保存液
  葡萄糖  2.05克 枸椽酸钠  0.8克
  氯化钠  0.42克 蒸馏水   100毫升
  将上述成分混匀,略加温使其溶解,分装小瓶(100毫升)。经10磅、10分钟高压灭菌。4℃保存备用。
  5. RPMI-1640培养液:

    RPMT-1640(FLOW公司出品)    1袋
    三蒸水            1000毫升
  电磁搅拌30分钟:1N HCl调PH7.2~7.4(约加2.5毫升),过滤除菌,作无菌试验,4℃保存。
  不完全RPMI-1640培养液:
   RPMI-1640             95毫升
   0.1M丙酮酸钠            1毫升
   0.2M谷氨酰胺             1毫升
   1M Hepes 1毫升
   7.5% NaHCO3 1毫升
   青霉素、链霉素(各1万单位)      1毫升
  完全RPMI-1640培养液
   不完全1640培养液          90毫升
   灭活胎牛(或新生牛)血清        10毫升

外周血培养基的配制
一、配制用水
  培养基的大部分是水,所以水的质量直接影响培养基的质量。按Waymouth标准,水的电阻应为200万欧姆,一般实验室里以玻璃蒸馏器制备的双蒸水或三蒸水可以符合使用条件。
二、培养基
  培养基有天然、人工两种。一般实验室使用的是RPMI-1640粉末培养基,以双蒸或三蒸水配制。NaHCO3(或HCl)调pH至7.2~7.4,若pH值超过7.6或远低于6.8,则大多数细胞不能生长。RPMI-1640不耐高压灭菌,使用前需经灭菌0.22μm孔径滤膜滤过处理。
三、血清
  培养中常使用小牛血清(或胎牛血清)。血清亦不能高压灭菌,无菌的小牛血清需在56℃水浴30分钟灭活补体,置4℃冰箱存放待用。配制时含量视培养细胞种类、时间而定,一般用10—15%。由于血清成分复杂、条件不易控制,可选用无血清培养基。
四、抗菌素
  为防止培养时期细菌的污染,可在培养基中添加适当抗菌素,一般用量与组织细胞培养相同:卡那霉素100单位/毫升,或双抗--青霉素100单位/毫升,链霉素100微克/毫升。
五、植物血凝素(PHA)
  非增殖期的细胞不能制备染色体,如人外周血淋巴细胞,但在离体培养过程中,在PHA的作用下,可被刺激转化为淋巴母细胞而进入有丝分裂。经实验测定其分裂高峰分别于培养后44—48小时和68—72小时。
  PHA有粘多糖,蛋白质两种重要成分。粘多糖促使有丝分裂,蛋白质起凝集作用。PHA激活的细胞数随其浓度而增加,直至全部免疫活性细胞均被激活为止,但PHA浓度过高会引起凝集,一般采用4%浓度为好。  
分享到:  QQ好友和群QQ好友和群 QQ空间QQ空间 腾讯微博腾讯微博 腾讯朋友腾讯朋友
收藏收藏 分享分享 支持支持 反对反对
您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册

本版积分规则

QQ|论坛App下载|Archiver|小黑屋|中国病毒学论坛    

GMT+8, 2024-12-24 00:25 , Processed in 0.125304 second(s), 31 queries .

Powered by Discuz! X3.2

© 2001-2013 Comsenz Inc.

快速回复 返回顶部 返回列表