[转移贴]狂犬病以及该病毒的Ｎ基因研究

cao1976

原贴由ccty0033 发表于 2008-5-16 14:09

１. 狂犬病病毒（rabies virus）
１.1 狂犬病病毒结构   
狂犬病病毒属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒属(Lyssavirus)，是引发狂犬病的病原。该病毒结构为直径为直径约为 75～80 nm，长约为 180～200 nm，一端钝圆，另一端平凹，呈子弹形或试管状外观。病毒颗粒由核心和外壳组成，外壳表面是病毒的表面糖蛋白，是病毒的主要表面抗原部分。糖蛋白镶嵌在脂质双层膜上，在双层膜的内侧是脂蛋白，也叫基质蛋白，核心部分是螺旋形的核衣壳，是由一条单链核糖核酸和包在它外面的核蛋白组成，在核衣壳内还有大转录蛋白和磷酸化蛋白两种蛋白。磷蛋白和大转录蛋白与RNA相互作用，一起形成具有活性的核糖核蛋白复合物（Ribonucleoprotein，RNP），M蛋白与RNP相互作用诱发机密卷曲的RNA蛋白骨架反转RNP诱导子代病毒粒子从感染细胞的外胞浆或者内质网出芽释放出来。狂犬病病毒RNA核蛋白复合体的结构有很高的特性保守性重叠、 RNA结合（RNA bound）以及装配(Assemble)。病毒颗粒模式图如图2-1。






１.2 狂犬病血清型和基因型分类
狂犬病病毒分为四个血清型，包括古典狂犬病病毒、街毒和疫苗株，血清Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型为狂犬病相关病毒，其原型株分别为Lagos bat（分离自尼日利亚）、Mokola（分离自津巴布韦）和Duvenhage（分离自南非）病毒。狂犬病病毒已确定有7种基因型：狂犬病毒(RABV，基因I型)，Lagos蝙蝠病毒(基因II型)，Mokola病毒(基因III型)，Duvenhage病毒(基因1V型)，欧洲蝙蝠狂犬病毒1 (EBLU-1基因v型)，欧洲蝙蝠狂犬病毒2 (EBLV-2，基因VI型)，以及澳大利亚蝙蝠狂犬病毒（ABLU,基因VII型）。
2.3 狂犬病病毒基因组
狂犬病病毒是一种负链RNA病毒,基因组单股不分节段，长度为11928—11932个核甘酸，基因组内含有5个基因（N、P或者NS、M、G、L），各结构基因分别编码核蛋白（NP）、磷酸蛋白（NSP）、基质蛋白（MP）、糖蛋白（GP）和大转录蛋白（LP）即 RNA 聚合酶，其中 N 蛋白、NS 蛋白和 L 蛋白与 RNA构成核衣壳，而 G 蛋白和 M 蛋白构成病毒囊膜；由基因组的3’端至 5’端依次排列着50bp 左右的先导序列（leader）、1424bp 的 N 基因、991bp 的 NS 基因、805bp 的 M 基因、1675bp 的 G 基因和 6475bp 的 L 基因以及 3`端尾巴（tailer）。各结构基因之间存在不编码的间隔序列，有时也称居间序列，其长度分别为 2bp(N-NS)、5bp(NS-M)、5bp(M-G)、  423bp(G-L) 。5种基因在基因组中的位点和大小如图2-2。





１.4 狂犬病病毒N基因（N Gene）和N蛋白（Nucleoprotein，NP）
１.4.1 N蛋白的结构和功能研究
N蛋白由N基因编码，是由450氨基酸残基组成的多肽，分子量约为50. 5ku,片段长1424bp。它是狂犬病毒毒粒中核衣壳的组成成份，是狂犬病病毒粒子的一种主要内部蛋白也是病毒中最稳定的蛋白，且能高效表达。
１.4.1.2 N蛋白主要功能位点
核蛋白上76-90、313-317、360-369、374-383段位点氨基酸对应N蛋白NII、NIII、IV、NI4个主要抗原位点，主要诱导机体产生可溶解和杀伤狂犬病病毒感染靶细胞的细胞免疫反应。分别用单克隆抗体分析,NP 有 3 个空间位置明显区别的抗原位点NⅠ、NⅡ、NⅢ，NⅠ、NⅢ分别与 374-383 和 313-337 位氨基酸的伸展有关。N蛋白免疫活性位点第374～383位氨基酸残基对狂犬病毒属不同型别和不同狂犬病毒株有较好的免疫反应[17]。NP多肽上有一些辅助性淋巴细胞（HelperTl-ymphocyte ，Th）表位，其中 404—418 对鼠有保护作用。氨基酸残基394-408、408-418 和 21-35 区段是 Th 细胞的主要表位，可在体内激活 Th 细胞；第 11-25 位氨基酸区段肽可促进 T 细胞的增殖。N基因分子间的相互作用有一个保守的模式，尽管其由不同的残基提供。
１.4.1.3 N蛋白对狂犬病病毒复制和转录的调控
N蛋白调控基因组的转录和复制。核蛋白在狂犬病病毒复制过程中与基因组RNA紧密结合形成核糖核蛋白(RNP)，保护病毒基因组RNA免受宿主细胞核酸酶的破坏。RNP还与磷酸蛋白(P蛋白)、大转录蛋白(LP)相互作用，形成转录与复制必须的螺旋对称结构[14]。Luo M等发现狂犬病病毒的N – RNA复合体的晶体结构曲率大于水泡性口膜炎病毒。较松弛的曲率使基底在RNA的堆叠更加紧密，同时螺旋附近的C（羟基）端进入创造的空间，以覆盖住结合的RNA 。这也许可以解释释放到细胞质后的RNA如何能从在病毒粒子中紧密的超螺旋的结构到宽松的线性结构的。病毒RNA从转录向复制方向的切换是由N蛋白是否核衣壳化先导RNA决定的。以病毒颗粒为材料纯化天然 NP较为困难，天然NP是一磷酸化蛋白，磷酸化位点位于C端 389位的丝氨酸ser。磷酸化位点直接影响N蛋白对先导RNA的核衣壳化的程度，这是由于未磷酸化的N蛋白在电荷方面比被磷酸化的N蛋白具有更强的碱性(正电性)，它与先导RNA的结合能力更强，能更好地使基因组核衣壳化。N基因蛋白浓缩狂犬病病毒RNA基因组，而且N-RNA复合体是RNA依赖性RNA聚合酶复合体介导的RNA复制和转录的摸板。狂犬病病毒重组的N-RNA复合体的原子结构决定了该病毒的复制和转录的结构和功能位点。狂犬病病毒N基因蛋白通过初期染色体RNA的衣壳化在病毒RNA的转录和复制过程中起着至关重要的作用。当狂犬病病毒N基因没有磷酸化时，病毒的转录和复制都将降低。
１.4.2  N基因与狂犬病防治研究
狂犬病是神经型疾病，尚无特效的药物和方法治疗发病后的患者。现今主要应用注射高质量的狂犬疫苗并联合使用抗狂犬病血清或免疫球蛋白来防制狂犬病。因此，疫苗研制成为防治狂犬病的关键，而目前疫苗研究的主要方向是口服型基因疫苗、DNA疫苗、基因缺失疫苗。有研究已经成功用伪狂犬病病毒构建出能准确表达狂犬病病毒P基因蛋白的重组基因病毒（rPRV/eGFP/rgp），用其作为狗的口服和肌肉注射不但安全，而且该病毒作为疫苗对伪狂犬病和狂犬病都有免疫力。
狂犬病病毒N蛋白是一种重要抗原，是基因工程和重组DNA技术的有效抗原蛋白之一。狂犬病病毒特异性抗原通过单一特性抗体抗狂犬病病毒核蛋白证实，而通过免疫组织化学分析交叉反应可检测到。通过免疫接种一种重组核蛋白基因的狂犬病病毒产生的兔抗毒血清证实各种狂犬病病毒的抗原交叉反应存在于用福尔马林固定的石蜡切片中 。核蛋白是病毒蛋白组成成分中最保守的成分之一，是除糖蛋白以外具有免疫原性的另一种重要结构蛋白，可促进中和抗体的产生，并参与细胞免疫反应。不同毒株间的核蛋白基因的序列存在高度的保守性、同源性，且核蛋白既具有所有RV共有的群特异性抗原决定簇。也具有RV基因1型和其他基因型共有的抗原决定簇，它能刺激机体产生高度一致的非中和性抗体。
Perea Arango 等用全长的狂犬病病毒核蛋白基因在转基因番茄植物上成功地进行表达。检测发现，可溶性蛋白量达到了1-5%,达到免疫的效果。免疫通过向老鼠腹膜内注射和口服包含了狂犬病毒核蛋白诱导的抗体产物的番茄蛋白提取液完成。李海涛等用克隆的犬2型腺病毒全基因组E3区进行部分缺失后，重组狂犬病病毒 SRV9株核蛋白基因获得狂犬病病毒核蛋白一重组犬2型腺病毒(CAV-2-RN)。Kuci -nskaite等[27]将RABV、EBLV-1和EBLV-2型狂犬病毒完整的N基因蛋白编码的序列片段成功地在啤酒发酵酵母中高水平的表达。RNA干扰(RNA interferenceRNAi)是近年来发现的短链双股 RNA可高效阻断其互补 mRNA转录的现象，该现象在包括人类在内的大多数物种体内广泛存在[1]。采用 RNaseIII消化长片段双链 RNA技术制备N基因siRNA Cocktail，其对 RV 的复制和感染产生更大的和关键性的影响，能够对RV的复制和感染产生明显和稳定的抑制作用，并且通过 RT-PCR在转录水平探测到 mRNA产量的降低。相信RNAi的出现为狂犬病新治疗手段的开发应用开辟新领域。
2.4.3  N基因与狂犬病分子流行病学
     由于N基因是狂犬病病毒基因组中最保守的基因，编码N蛋白。不同株系的N蛋白同源性在98 % ~99.6%之间，当同源性低于80%时即可判为不同基因型。所以可通过测定和比较各毒株N基因的序列作为不仅可用于检测狂犬病病毒感染 ，作为狂犬病病毒分类的重要依据 ，也广泛用于狂犬病流行病学研究。
单克隆抗体检测抗原变异、放射性标记的核酸探针杂交方法、RT-PCR相继成为分子流行病研究主要方法，但目前RT-PCR应用得更普遍。其技术步骤主要为先RT- PCR方法扩增N基因片段，然后再进行基因序列测定，对狂犬病病毒进行病毒检测、基因分型和系统发育分析，从而进行狂犬病的分子流行病学研究。
通过测定狂犬病病毒属中具有代表性的病毒分离物N基因的序列，Bourhy等、Skerratt等、de Mattos等确定了狂犬病原的7个基因型：基因型1(狂犬病病毒，RABV)、基因型2(拉各斯蝙蝠病毒，LBV)、基因型3(莫科拉病毒，MOKV)、基因型4(杜文海洛病毒，DI rvv)、基因型5(欧洲蝙蝠狂犬病病毒1，EBLV-2)、基因型6(欧洲蝙蝠狂犬病病毒2，EBLV一2)、基因型7(澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒，ABLV)。根据N基因突变绘制的病毒迁移图谱，可以找到病毒的传播路线和历史变迁的证据。
广西狂犬病分子流行病学研究一直走在国内的前列，先后有多批学者对广西狂犬病不同毒株的N基因进行克隆和测序，并进行了分子流行病学分析。
古漓等测定广西不同地区、不同时间分离的8株狂犬病病毒街毒株的基因型，并与国内外的其它毒株进行N基因的序列比较，发现同一地区之间核苷酸序列同源性差异小于2％(从广西玉林地区分离到的3株狂犬病病毒街毒株同源性大于98％，从广西柳州地区分离到的3株同源性也大于98％)，而二地区间差异在15％ 以上(柳州毒株和玉林毒株相比)，广西与美国、南非、墨西哥毒株相比，差异达25％以上，玉林毒株与越南的靖西毒株相近，柳州毒株与安徽毒株(CNB -V1313)相似，宁明的1株与泰国株相似，故认为广西8株狂犬病病毒呈现地域性分布，存在有不同来源的病毒株。熊毅等通过测定来自广西的16份狂犬病野毒株N基因，分析发现全部毒株都属于Ⅰ型，分为三个群。Ⅰ群和Ⅱ群同源性分别在97.9-99.8%和98.7-99.9%之间；Ⅲ群中只有一株，与 8738THA 株 N 基因核苷酸的同源性为 95.3%；3个群的分布具有一定的地域特征性。16份狂犬病野毒株分布：I群主要分布在桂东地区，其中 Ia 亚群主要分布在桂东南，而 Ib 亚群主要分布在桂东北，Ⅱ群的毒株有 5 株，主要分布在桂西，Ⅲ群只有 1 株 GX119，从南宁分离得到，但 GX119 株与泰国、马来西亚的毒株同属于一个群。N 蛋白氨基酸的变异主要集中在42、90、110、128、135、332、379、397位8个氨基酸上。广西狂犬病毒株核蛋白磷酸化位点、主要抗原位点和 Th 细胞的主要表位非常保守，只有个别氨基酸发生变异。据此也可以推断，狂犬病病毒基因型的分类带有一定的地域性。
而为对于全国狂犬病分子病毒的分析，徐葛林等测定了30年来从我国不同动物中分离的19个中国狂犬病病毒街毒株N基因的部分核酸序列，并对其差异做了比较分析，认为中国狂犬病病毒街毒株可分为4个组群，各组群的同源性为83．45％ ～88．62％ ，除广西地区分离的狂犬病病毒街毒株彼此差异较大外，其余街毒株的地理分布与其N基因核酸序列差异的距离是密切相关的，基本上可按其地理分布分为东、西二大组。

1.1狂犬病
狂犬病（Rabies）又称恐水症，是一种由于感染了自然染界中具有特有种属嗜神经性狂犬病毒，侵犯中枢神经系统而发生的的致命性疾病为主要的人畜共患的急性传染病，一但发病，死亡率几乎是百分之百。本病是典型的自然疫源性疾病，野生动物是狂犬病的自然疫源地，所有的温血动物均可感染。犬和蝙蝠是本病病毒的最重要带毒和传播者。狂犬病病毒的传染，主要通过皮肤伤口与粘膜（包括口腔、呼吸道、鼻粘膜传播）。在绝大多数狂犬病动物的唾液腺内，其狂犬病病毒含量达50~90%。狂犬病感染示意图如图1-1
     











1.2 狂犬病流行病学
1.2.1 病理、诊断及防治
狂犬病发病经过局部组织内繁殖期、侵入中枢神经期、向各器官扩散期三个过程。研究发现，狂犬病尽管是致命性的，但病毒通过感染神经中枢系统导致相对轻微的病理学变化，而非严重的神经性死亡 。Anirban Roy等的实验显示在免疫通过被感染中枢神经系统的入口有限的传染平台上，不管是抗病毒免疫的量和效果都将降低。不过致命性SHBRV的感染动物可以通过打开血脑屏障得到保护[7]。狂犬病临床表现的特征为恐水怕风、咽肌痉挛、进行性瘫痪、呼吸困难、吞咽困难等。确诊有赖于病原学检测或尸检发现脑组织内基小体。一般实验室检测包括狂犬病病毒抗原和抗体检测。基因检测技术则比较准确，包括各种病毒核酸检测方法。罗廷荣等建立了Nested PCR，并证明其与RT-PCR技术能快速、准确地从带毒材料中检测到狂犬病病毒，可用于临床诊断以及流行病学调查研究。而最新的还有基因芯片检测狂犬病毒技术 。本病暂无特效药物，重于预防。主要使用疫苗和高免血清进行预防和治疗。
1.2.2 世界流行情况
狂犬病在我国曾一度得到有效控制，但近年来疫情回升很快 ，正迎来第3次高峰 ，形势之严峻可想而知。动物疫苗免疫效果达不到要求是出现这种形势的主要原因。据统计，本病在87个国家有流行，主要流行于东南亚、亚洲及拉丁美洲地区。发达国家由于对人和狗进行预防接种而使本病得到控制。发展中国家（包括我国）的主要传染源为病犬，其次为猫和狼。而发达国家，本病主要由野生动物如狐狸、食血蝙蝠、臭鼬、浣熊等传播。以美国和加拿大为例，上世纪80年代至今，SHBRV（silver-haired bat rabis virus）成为导致诱发狂犬病死亡的最大杀手。目前中国的狂犬病例数仅次于印度，居全球第二,属于世界上狂犬病严重流行的国家之一，国内发病主要集中在中小城市、农村及边远山区。据世界卫生组织统计，每年全球都有超过55000人死于狂犬病。报告显示，2004-2006年，全国（不含台港澳）分别报告了2651、2537、 3279例狂犬病病例，三年合计报告死亡数8403例，占同期各种传染病病死数的30.1%，高居37种法定传染病报告病死数之首。疫情最严重的5个省份分别是广西、贵州、四川、湖南和广东。狂犬病由于病程短、病死率极高、临床症状极其凶残，己经发展成为严重的社会公共心理卫生问题，因此控制甚至消除狂犬病具有重要意义。