[转移贴]请教老师们鸡胚肾细胞的原代培养方法及病毒培养的几个问题

hantavirus

原贴由笑语呢喃 发表于 2010-3-6 13:10

各位老师好：
    我是新手，我现在要做鸡的病毒，需要LMH细胞做病毒培养用，但是LMH细胞国内细胞库都没有卖的，有这个细胞的两个国内实验室发了邮件过去，好几天无音讯，估计赠与的希望也不大了。ATCC的又贵到货周期又很长，现在考虑自己先做做原代鸡胚肾细胞培养用来培养病毒。但是从来没有养过原代细胞，查阅了相关文献对于鸡胚肾细胞原代培养也没有详细的步骤与方法，现在请假论坛里面的老师帮帮我把，你们都有经验。能不能提供我培养鸡胚肾细胞的详细步骤及注意事项？

还有几个问题请教：我的病毒文献报道只能在LMH细胞或者鸡胚肾细胞上培养，前者估计弄不到了，我要是用原代鸡胚肾细胞进行培养有几个问题我没有把握。
1、我现在只有含有病毒的粪便上清液，滴度较低，我想在细胞上传代之后纯化病毒。原代细胞符合条件吗，我担心培养的不纯或者细胞活力与密度不够，原代细胞好像也不能多次传代的。
2、好担心在攻毒传代的过程中病毒给弄丢了，我是不是应该做实时定量进行检测病毒的滴度。我的病毒文献报道在细胞上可能会产生CPE，但是不同的病毒株可能存在很大差异，我不清楚我分离的病毒株是否真的可以产生细胞病变，如果没有的话我还能将病毒纯化出来吗？
3、如果病毒在细胞上收获后还有必要进行鸡胚传代吗？我最开始想直接用SPF鸡胚攻毒，但是手里面的粪便上清液比较少，也不能确定其病毒的含量，而且病毒本身致病性较低，而且自己的实验室还没有成熟的方法可以借鉴。不知道能否收获病毒。

问题多了些，请求老师给新人解答一下，我很想将病毒纯化出来，这样后续才能做一些工作，但是好像总是遇到问题。非常感谢！！！

hantavirus

半拉木匠发表于 2010-3-6 22:20 :

针对你的问题大概有以下解答
首先你的担心都很对  也都有可能  
个人对你的情况推测如下：手头病料很少、活性未知。因此当务之急就是找到合适的方法尽可能的繁殖一定数量的病毒保证数量最好能兼顾质量 然后分装冻存作为原始种子库。 为后续的任意折腾留足源。
   因为对你的病毒不熟悉，所以有点疑问：
   你的这株病毒在体外培养的鸡肾细胞上易感还是在鸡胚上易感？有无数据或理论支持？  
这点很重要。因为有些病毒在实体器官/胚胎上的感染能力优于体外培养的细胞的，除非是经过大量实验证实的模式细胞或者是该病毒经过了特定细胞系的传代适应（你的是野生型，也就不存在传代适应了）。因此在初期繁殖阶段一定要确定最最敏感的宿主，然后用其进行繁殖，保证原始种子质量（留得青山）。后期再考虑其他简单易行的手段。
   关于你的疑虑，因为有其他病毒的经验，至于你的病毒没做过，所以提供些理论技术：
1. 原代细胞可以进行病毒繁殖，前提是属模式细胞并且细胞质量有保证。
   例如 原代牛肾细胞培养牛腹泻病毒  原代地鼠肾细胞培养的 狂犬 出血热 乙脑 。
   没做过鸡肾细胞的分离培养 只能借鉴地鼠等动物的经验 只要方法得当技术过关（母体动物的质量不用考虑 SPF鸡蛋好买的很）理论上是可以分离并培养得到各项指标合格的原代细胞的(原代地鼠肾的分离工艺相当成熟,本人可提供些许地鼠工艺帮助)
    应用原代细胞进行病毒传代时不用考虑细胞传代问题,分批进行细胞分离然后逐步进行病毒传代,如此产生变异的几率是小于应用不同代次细胞进行病毒扩增的.
2. 病毒产生丢失或者活性升高都有可能, 如果有条件进行实施滴度检测室最好的了,如果条件不具备,进行标记示踪(化免/放免)  目的样品与标记样品平行进行,根据表几组的活性数据判断未标记组的情况.  如果可以进行实时监测或者示踪 那么无CPE就不是问题了.
3. 关于细胞传代后是否有必要进行鸡胚传代 就又回到了二者谁更敏感的问题.  除非有特殊的研究需要 交叉传代制造选择压力来改变病毒(一般减毒株的制备过程中采用大量传代及交叉传代).
     另有些利弊建议:
     如果鸡胚可以进行传代的话就尽量不要自己进行原代细胞分离了,因为原代细胞分离耗时耗力,且需要一定的技术经验,并且该步骤必须做好做扎实 因为细胞的质量决定了后续病毒的质量  眼下又没有现成的可借鉴经验 投入大了势必影响实验进度.
      使用原代细胞进行病毒传代的工作量远远多于鸡胚法:要在每代次病毒传代病变后立即备足下一批次细胞  如此循环 可能需要很多代. 如果不进行如此连贯培养就存在两个问题: 工作效率低、病毒初始几代活性可能低 ，冻存会产生病毒损耗 导致活性峰值出现迟缓。
    经过不太成熟的手段制备的原代细胞产生的批间必将明显大于SPF鸡蛋的批间差，该差异也就会影响病毒质量。
   
     无实战经验，只能推敲着纸上谈兵  帮帮场吧  仅供参考：）

hantavirus

笑语呢喃 发表于 2010-3-7 14:02 :

非常感谢“半拉木匠”老师。您的分析让我很有启发，现在把我的一些情况说明如下，期盼得到您的进一步的指导和帮助。

（1）        我的这株病毒是在粪便上清中分离，是鸡的肠道病毒，主要引起鸡的发育迟缓和可能的肾脏损伤，基本上属于和其他的肠道病毒混合感染，致病力较弱，只能对稚鸡感染，感染率比较高，但不致明显症状的疾病。成年鸡隐形感染一般不表现临床症状，但是可以检测到很高的抗体阳性率，正常的鸡中也可以分离到。很多文献报道都认为该病毒不好用细胞培养，所以目前的致病性等都不是很清楚。有些文献报道的这类病毒可以在鸡胚肾细胞和鸡胚肝细胞上培养，但我不清楚为什么有的选择胚肾细胞有的选择肝细胞？在鸡胚上也易感。文献报道可以通过绒毛尿囊膜接种10日龄的SPF鸡胚，但是还没有看到用粪便上清接种的，基本上都是患病鸡的肠道内容物或者器官组织的悬液，我想本身他们用的悬液中病毒的含量就应该比较高吧。
（2）        我现在的问题确实是病料少（目前大约还有4-5ml的粪便上清液），病毒活性不清楚，滴度我想应该不高，用粪便上清扩增病毒的时候我用的都是套式PCR，最麻烦的是我现在的病毒是从什么样的鸡的身上分离出来的不清楚，不知道年龄不知道健康状况，啥都不清楚，是实验室保存的粪便样本，实验室还没有人做过鸡的病毒，我来了以后就拿这批样本进行筛选了，这似乎有点盲目，但是重新进行采样筛选阳性样本工作量太大了，又很费钱，考虑到现在既然已经获得了病毒的全长序列，所以也就想做下去。
（3）        我想将病毒纯化出来做致病性的研究，但是目前看来从培养到纯化这个道路觉的很艰辛，因为很多都要自己摸索，很担心时间太长完不成工作，就想您建议的那样。不管我以后做那个，好像病毒纯化不出来或者不能得到滴度高一些的病毒好多想法都不太可行。我想如果我构建病毒样颗粒，对于解决这个问题有没有写帮助呢，虽然病毒样颗粒不能复制，但是是不是也可以作为假病毒进行后续工作的研究呢？我想有写工作要是能同时进行的话是不是会好些呢？

我是初次接触病毒研究，以前是做基因的分子生物学的，这个转变对我来说有点吃力，很多问题可能需要慢慢的学习，非常感谢您，希望得到您的第二次回复，谢谢！！！

hantavirus

半拉木匠发表于 2010-3-7 15:05:

1.        报道使用胚肾、胚肝，其实无所谓可能这两种细胞都属于易感。 至于没有使用粪便上清接种的先例  那可能是如你所推测的 脏器组织内的病毒含量高  但是这个不好定论，因为有些肠道病毒在初期是粪便中含量高的（比如HAV） 也有可能是前人碰巧采用了比较直接的肠道内容物取样法。
2.        至于小鸡的背景资料追溯不到倒也无妨 只要你能P出东西就行呗。关键在于能否使用PCR检测病毒含量？哪怕只是个模糊的范围也行（不了解所以问的有点外行：））。如果没有流调方面的资料、盲目去筛确实工作量太大，赞先不用考虑。既然鸡胚易感 要是再能确定原料活性就可以考虑暂时鸡胚扩增种子。
3.        对于基因工程方面知之甚浅，理论上倒是可行，但是前提是得确定保护性表位/片段  有这方面资料么？ 如果没有的话构建出来的颗粒怎样鉴别？ 最好可以同时进行啊
不要客气，大家就是交流 称不上老师  这坛子里高人很多  你别着急。 如果能帮忙的大家都会尽力的  有什么疑问或者反馈你就尽管提来吧。