人杯状病毒的检测

wwwkkk83

一、ELISA检测人杯状病毒

采用IDEIA™ Norovirus试剂盒（DakoCytomation公司），仅限于检测人杯状病毒中的诺如病毒（属）GⅠ和GⅡ型。

（一）检测前准备工作

1.粪便标本处理：加入1ml样品稀释液（sample diluent）至1.5ml EP管中，加入0.1g固体粪便标本或0.1ml液体粪便标本，置于漩涡震荡器混匀，室温静置10min，室温下≥5000rpm离心5min。

2.阴性对照：将1ml样品稀释液（sample diluent）加至标记好的小瓶中作为阴性对照。

3.阳性对照：1ml对照稀释液（control diluent）溶解阳性对照，使用前混匀。

4.洗液的配制：1倍体积的洗液浓缩液，加9倍体积的去离子H2O。当天用当天配。

（二）标本检测

1.    将需要数量的微孔板置于微孔板架上。

2.    每孔加入100µl 10％便悬液或阴性对照或阳性对照（每次检测均需加一个阳性对照和一个阴性对照），20～30℃静置60±5min。

3.    每孔加入2滴（或100µl）酶结合物（conjugate），用枪头轻柔混匀。

4.    每孔加入350µl洗液，洗5次，在卫生纸上拍干。

5.    每孔加入2滴（或100µl）底物液（Substrate），20～30℃静置30min。待蓝色显现后迅速观察颜色。

6.    每孔加入2滴（或100µl）终止液（Stop solution），充分混匀。

7.    读取OD450值，打印输出或记录OD值。结果必须在加入终止液后30min内读取。

(三) 检测结果的判定：

1.    阴性对照：肉眼观察无色或OD450值<0.15。

2.    临界值：OD450值＝阴性对照OD450值＋0.10。

3.    阳性对照：肉眼观察呈现独特的蓝色或OD450值>0.50。

4.    标本：肉眼观察蓝色比阴性对照颜色深判定为阳性，肉眼观察无色判定为阴性；或者OD450值大于临界值判定为阳性，小于临界值判定为阴性，OD450值在临界值±0.01范围内判定为可疑，应重复检测。

（四）注意事项：

1.打开后的96微孔板应置于可封口的有干燥剂的口袋中贮存于2～8℃，打开后6周内用完。

2.终止液中含0.3mol/L硫酸，避免接触到皮肤和粘膜。如果终止液接触到这些部位立即用水冲洗。

3.未用完的阳性对照可在2～8℃贮存1个月，长期贮存应分装存于-20℃。

4.底物液避光保存，不要使用已经变蓝的底物液。

5.避免污染。

二、人杯状病毒RT-PCR检测

可以同时检测出人杯状病毒中诺如病毒（属）和扎如病毒（属）。

（一）病毒RNA提取：

1．提取前的准备工作：

（1）    将1ml Buffer AVL加入装有低压冻干的Carrier RNA中，彻底溶解Carrier RNA后，将溶有Carrier RNA的Buffer AVL转入至Buffer AVL瓶中，彻底混匀。分装贮存于2～8℃。如果在2～8℃时，Buffer AVL/Carrier RNA溶液形成沉淀，可在80℃重新溶解，注意加热的时间不能超过5min，用前冷却至室温。Buffer AVL/ Carrier RNA溶液不能加热超过6次。

（2）    加入合适比例的96～100％的酒精至Buffer AW1中，19ml的Buffer AW1加入酒精25ml。

（3）    加入合适比例的96～100％的酒精至Buffer AW2中，13ml的Buffer AW2加入酒精30ml。

2．病毒RNA的提取：

（1）    在1.5ml EP管中加入560µl 已加入Carrier RNA的Buffer AVL。

（2）    将140µl 10％便悬液加入至EP管中的Buffer AVL中，vortex混匀15sec。

（3）    室温（15～25℃）孵育10min。

（4）    将1.5ml EP管轻微离心，以去除管内的液滴。

（5）    在管内加入560µl 96～100％的酒精，vortex混匀15sec。混匀后，将1.5ml EP管轻微离心，以去除管内的液滴。

（6）    小心的将630µl步骤5中的溶液加入至已放入至2ml收集管中的QIAamp离心柱中，注意不要弄湿柱子边缘。盖上盖子，8000rmp离心1min。将QIAamp离心柱放置至另一干净的2ml收集管中，弃去包含有滤过液的收集管。

（7）    小心打开QIAamp离心柱的盖子，重复步骤6。

（8）    小心打开QIAamp离心柱的盖子，加入500µl Buffer AW1。盖上盖子，8000rmp离心1min。将QIAamp离心柱放置至另一干净的2ml收集管中，弃去包含有滤过液的收集管。

（9）    小心打开QIAamp离心柱的盖子，加入500µlBuffer AW2。盖上盖子，14,000rmp离心3min。弃去收集管中的滤过液，14,000rmp离心空柱子1min。

（10）将QIAamp离心柱放置入干净的1.5ml离心管中。弃去包含有滤过液的收集管。小心打开QIAamp离心柱的盖子，加入60µl Buffer AVE至离心柱中，盖上盖子，室温孵育1min。8000rmp离心1min。（2×40µl的Buffer AVE洗脱两次，能增加产量。）病毒RNA进行反转录，或贮存于－20℃或－70℃备用。

（二）人杯状病毒ssRNA的反转录：

在0.2mlEP管中配制如下逆转录体系。

10×缓冲液                        2.5 µl

25 mM MgCl2                        4 µl

2.5mM dNTPs                         5µl

1% BSA                                2.5µl

0.2 µg/ µl引物289混合液        1µl

10 U/µl AMV-RT                0.35µl

50 U/µl RNasin                      0.1µl

DEPC处理H2O                  8.05µl

RNA                                      1.5µl

共25µl，混匀，轻微离心，42℃反转录1hr。

（三）人杯状病毒cDNA PCR扩增

在0.2ml EP管中配制如下PCR体系：

10×缓冲液　　　　　　　　5µl

25mM MgCl2　　　　　　　 4µl

10mM dNTPs　　　　　　　 1µl

0.2 µg/ µl引物289混合液　 1µl

0.1µg/ µl引物290混合液　　1µl

5 U/µl Taq酶　　　　　 0.4 µl

DEPC处理H2O　　　　　  29.6µl

cDNA　　　　　　　　　    8µl

共50µl，混匀，轻微离心，放入PCR仪中扩增，反应条件：94℃变性3min后，94℃ 60s，58℃1min20s，72℃1min，进行30个循环，72℃延伸10min。反应结束后1.5％琼脂糖凝胶电泳或4℃保存PCR产物。

表1  人杯状病毒RT-PCR所用的引物

引物	位置	方向	核酸序列(5’–3’)
289H	4865-4886	-	TGACGATTTCATCATCACCATC
289I	4865-4886	-	TGACGATTTCATCATCCCCGTC
290H	4568-4590	+	GATTACTCCAGGTGGGACTCCAC
290I	4568-4590	+	GATTACTCCAGGTGGGACTCAAC
290J	4568-4590	+	GATTACTCCAGGTGGGATTCAAC
290K	4568-4590	+	GATTACTCCAGGTGGGATTCCAC

（四）检测结果的判定：

取15µl RT-PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳。人杯状病毒诺如属扩增产物大小为319bp，扎如属扩增产物大小为331bp。

（五）注意事项：

1.    枪头避免触及QIAamp离心柱的滤过膜。

2.    避免污染。应该戴手套进行操作。PCR实验室应该分为3个区：试剂准备区，样品准备区，扩增和检测区。

3.    EB可能致癌，必须小心操作，划定EB污染区。

TBvirus

感谢楼主分享。