2010版药典征求意见之“冻干人用狂犬病疫苗（Vero 细胞）”

cao1976

冻干人用狂犬病疫苗（Vero 细胞）

Donggan Renyong Kuangquanbing Yimiao(Vero Xibao)

Rabies Vaccine for Human Use（Vero cell）， Freeze-dried

本品系用狂犬病病毒固定毒接种于Vero细胞，经培养、收获、浓缩、灭活病毒、纯化后，加入适宜稳定剂冻干后制成，用于预防狂犬病。

1
基本要求

生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”有关要求。

2
制造
2.1
生产用细胞
生产用细胞为Vero细胞。
2.1.1细胞管理及检定
应符合“生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程”规定。各种子批代次应不超过批准的限定代次。
取自同批工作细胞库的1支或多支细胞管，经复苏扩增后的细胞仅用于一批疫苗的生产。
2.1.2 细胞制备
取工作细胞库中的1支或几支细胞管，细胞复苏、扩增至接种病毒的细胞为一批。将复苏后的单层细胞用胰蛋白酶或其他适宜的消化液进行消化，分散成均匀的细胞，加入适宜的培养液混合均匀，置37℃培养成均匀单层细胞。
2.2毒种
2.2.1名称及来源
生产用毒种为狂犬病病毒固定毒CTN-1V、aGV株或其他经Vero细胞适应的狂犬病病毒固定毒株。
2.2.2种子批的建立

应符合“生物制品生产和检定用菌毒种管理规程”规定。各种子批传代应不超过批准的限定代次。狂犬病病毒固定毒CTN-1V株在Vero细胞上传代， 至工作种子批传代次数应不超过35代，aGV株在Vero细胞上传代，至工作种子批传代次数应不超过15代。

2.2.3种子批的检定
主种子批应进行以下全面检定，工作种子批应至少进行2.2.3.1-2.2.3.4项检定。
2.2.3.1鉴别试验
用小鼠脑内中和试验鉴定毒种的特异性。将毒种作10倍系列稀释， 取适宜稀释度病毒液与等量抗狂犬病病毒特异性免疫血清混合，同时设立正常血清对照组， 试验组与对照组的每个稀释度分别接种11-13g小鼠6只，每只脑内接种0.03ml， 观察14天，中和指数应不低于500。
2.2.3.2 病毒滴定
取毒种作10倍系列稀释， 每个稀释度脑内接种体重为11-13g小鼠至少6只，每只脑内接种0.03ml， 观察14天，病毒滴度应不低于7.5 LgLD50 /ml。
2.2.3.3无菌检查
依法检查（附录XII A ）， 应符合规定。
2.2.3.4 支原体检查
依法检查（附录XII B ）， 应符合规定。
2.2.3.5病毒外源因子检查
依法检查（附录XII C）， 应符合规定。

2.2.3.6免疫原性检查

用主种子批毒种制备灭活疫苗，腹腔注射体重为12-14g小鼠，每只0.5ml。7天后重复接种1次作为试验组，未经免疫小鼠做对照组。第一次免疫后的第14天，试验组和对照组分别用10倍系列稀释的CVS病毒脑腔攻击，每只0.03ml，每个稀释度10只小鼠。保护指数应不低于100。

2.2.4 毒种保存

毒种应于-60℃以下保存。

2．3
原液

2．3．1
细胞制备

同2.1.2项。

2．3．2培养液

培养液为含适量灭能新生牛血清的MEM、199或其他适宜培养液。新生牛血清的质量应符合规定（附录XIII D）。

2．3．3 对照细胞外源因子检查

依法检查（附录XII C），应符合规定。

2．3．4病毒接种和培养

细胞培养成致密单层后，毒种按0.01-0.1 MOI（同一工作种子批应按同一MOI接种）接种，置适宜温度下培养一定时间后，弃去培养液，用PBS冲洗去除牛血清，加入适量维持液，置33-35℃继续培养。

2．3．5 病毒收获

经培养适宜时间，收获病毒液。根据细胞生长情况，可换以维持液进行多次病毒收获。同一细胞批的同一次病毒收获液检定合格后可合并为单次病毒收获物。
2．3．6单次病毒收获液检定
按3.1 项进行。

2．3．7 单次病毒收获液保存

于2-8°C保存不超过30天。
2.3.8合并、浓缩
同一细胞批生产的多个单次病毒收获液检定合格后可进行合并。合并后的病毒液，经超滤或其他适宜方法浓缩至确定的蛋白质浓度范围

2．3．9 病毒灭活

于浓缩后的病毒收获液中按1：4000的比例加入β—丙内酯，置适宜温度、在一定时间内灭活病毒，并于适宜的温度放置适宜的时间，以确保β-丙内酯完全水解。病毒灭活到期后， 每个灭活容器应立即取样，分别进行病毒灭活验证试验。

2.3．10 纯化

灭活后的病毒液采用柱色谱或其他适宜的方法进行纯化，纯化后可加入适量人血白蛋白或其他适宜的稳定剂即为原液。
2.3．11 原液检定
按3.2项进行。

2.4 半成品

2．4．1 配制

用疫苗稀释液将原液按同一蛋白质含量及抗原量进行配制，配制后总蛋白质含量应不高于80µg/剂， 并加入适宜的稳定剂即为半成品。

2.4．2 半成品检定
按3.3项进行。

2．5 成品

2．5.1分批

应符合“生物制品分批规程”规定。

2．5.2 分装及冻干

应符合“生物制品分装和冻干规程”规定

2．5.3规格

复溶后每瓶0.5ml。每1次人用剂量为0.5ml，疫苗效价应不低于2.5IU。

2．5.4 包装

应符合“生物制品包装规程”规定。

3检定

3.1单次病毒收获液检定

3.1.1 病毒滴定

按2.2.3.2项进行，病毒滴度应不低于6.0 LgLD50 /ml。

3.1.2 无菌检查

依法检查（附录XII A），应符合规定。

3.1.3 支原体检查

依法检查（附录XII B），应符合规定。

3．2原液检定

3．2．1无菌检查

依法检查（附录XII A），应符合规定。

3.2.2 病毒灭活验证试验

将病毒灭活后供试品25ml接种于Vero细胞上， 每3cm2单层细胞接种1ml供试品 ，37℃吸附60分钟后加入细胞培养液，与供试品量比例不超过1：3， 每7天传1代， 将培养21天后的培养液混合取样，分别进行动物法和酶联免疫法检测。动物法为脑内接种体重为11-13g小鼠20只，每只0.03ml， 观察14天，应全部健存（3天内死亡的不计， 动物死亡数量应不超过试验动物总数的20%）；采用酶联免疫法检查，应为阴性。

3.2.3 蛋白质含量

取纯化后未加入人血白蛋白的病毒液，依法测定，应不高于80μg/剂（附录VI B 第二法）。

3．2．4抗原含量

采用酶联免疫法，应按批准的标准执行。

3.3半成品检定

无菌检查

依法检查（附录XII A），应符合规定。

3．4成品检定

除水分测定外，按制品标示量加入灭菌注射用水，复溶后进行以下各项检定。

3．4．1鉴别试验

采用酶联免疫法检查， 应证明含有狂犬病病毒抗原。
3．4．2外观
应为白色疏松体，复溶后应为澄明液体，无异物。
3.4.3 化学检定

3．4．3.1 pH值

应为7.2-8.0（附录V A）。

3.4.3.2 水分

应不高于3.0%（附录VII D）。

3.4.4 牛血清白蛋白残留量

应不高于50ng/剂（附录VIII F）。

3.4.5 Vero细胞DNA残留量

应不高于100pg/剂（附录IX B）。

3．4．6 效价测定

应不低于2.5IU/剂（附录XI A）。

3．4．7 热稳定性试验

疫苗出厂前应进行热稳定性试验。于37℃放置28天后，按3.4.6项进行效价测定。如合格， 视为效价测定合格。

3.4．8无菌检查

依法检查（附录XII A），应符合规定

3．4．9 异常毒性检查

依法检查（附录XII F），应符合规定。
3.4.10细菌内毒素检查
应不高于50EU/剂（附录XII E 凝胶限量试验）。
3.4.11 抗生素残留量检查
细胞制备过程中加入抗生素的应进行该项检查， 采用酶联免疫法，应不高于10ng/ml。
3.4.12 Vero细胞蛋白残留量测定
采用酶联免疫法， 应不高于4ug/ml， 并不得超过总蛋白质含量的5%。

4.保存、运输及有效期

于2-8℃避光保存和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。
5 疫苗稀释剂
疫苗稀释剂为灭菌注射用水，应符合对疫苗稀释剂有关要求。
5.1疫苗稀释剂装量
5.2 疫苗稀释剂包装
5.3 疫苗稀释稀释剂有效期
5.4 疫苗稀释剂批准文号
5.5 疫苗稀释剂生产企业
6. 说明书