聊一聊HBV DNA定量测定

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　乙型肝炎患者在采用干扰素或核苷类似药进行抗病毒治疗时，患者外周循环中HBV　DNA的含量是抗病毒治疗疗效唯一直接的指示标志物，患者进行抗病毒药物治疗期间，每1~3个月需要检测一次。此外，HBV DNA是独立于HBeAg和ALT以外能够独立预测肝硬化发生的危险因素，HBV DNA> 2,000 IU/mL（相当于10^4拷贝/mL）是肝硬化和HCC发生的显著危险因素。HBV DNA的准确和具有可重复性的定量，是保证其能很好地用于上述患者治疗的前提条件。

1. 拷贝与国际单位的换算

　　关于HBV DNA的IU/ml与拷贝/ml之间的换算问题，是国内同道经常提出的一个问题。2010年版《慢性乙型肝炎防治指南》中也提到HBV DNA的检测值可以国际单位(IU)/mL或拷贝/mL表示，根据检测方法的不同，1 IU相当于5~6拷贝。根据这一点，国内临床医生通常对于采用国产HBV DNA实时荧光定量PCR试剂检测结果也按这个来换算，以为是一个通用的计算公式，这是错误的。因为1 IU相当于5-6拷贝，不具有普遍性，不适用于所有商品试剂盒。如果说1 IＵ/ml相当于罗氏（Roche）的Cobas、Bayer bDNA等检测系统的5-6拷贝/ml，则是较为准确的。这是因为在HBV DNA检测的商品检测系统最早应用的是Cobas amplicor，其结果报告单位是拷贝/ml，其后其它一些商品试剂如支链DNA（branched DNA, bDNA）、Digene杂交捕获试验等也是用的拷贝/ml，但不同方法间的拷贝/ml没有可比性。世界卫生组织（WHO）的HBV DNA标准物质（97/746, 10^６IU/ml)在2000年发布后，罗氏公司即用其Cobas amplicor检测系统（PCRELISA）检测了该标准物质，发现1 IU/ml约等于其检测系统的5.26拷贝/ml，后来，罗氏又研发了基于实时荧光PCR的Cobas-Taqman检测系统，检测后，1 IU/ml约等于5.82拷贝/ml。Bayer采用theVERSANT HBV DNA 3.0 assay bDNA检测系统，1 IU/ml约等于5.6拷贝/ml。其它一些商品试剂如Digene杂交捕获试验（the Digene Hbride-Capture assay）等也应有其拷贝/ml与IU/ml的换算系数。

　　HBV DNA检测用国际标准物质（reference material）是指由WHO多中心研究后由专门委员会认可的，经过稳定性和组成完整性检验的，在国际范围内用作有关量的其他标准定值的基础的物质，目前由英国国家生物学标准物质和质控物研究所（National Institute for Biological Standards and Control, NIBSC）研制并提供。NIBSC于2000年建立了第一代HBV DNA（97/746，10^６IU/ml国际标准，2008年推出了第二代。国际标准通常采用多中心合作研究定值，参加实验室数目应取决于研究的目的，原则上，实验室的数目要多于所选择的实验方法的数目，保证每种方法有多个实验室使用。第一代HBV DNA国际标准的多中心合作研究由分布于9个国家的22个实验室参加，要求每个参加实验室每隔一定时间（通常1星期或更长时间）进行一次独立实验，共进行四次独立实验。如果采用定量实验，每次实验中的样本及稀释系列（10倍稀释，包括原倍、1：10和1：100）都要进行双孔检测。然后对定量检测的数据进行统计学处理。如果实验室采用的为定性实验，则第一次独立实验时，参加实验室可以对样本进行10倍系列稀释，粗略确定终点浓度（end-point concentration）。自第二次实验始，要选择上次实验确定的终点浓度的上下共5个0.5log稀释系列进行实验。然后统计每个稀释浓度的检出率。假定每个稀释浓度测定的阳性结果符合piosson分布，选择检出率接近63%的浓度作为终点浓度，终点浓度乘以稀释倍数即得到标准物质的量值，单位为“可检出单位”（detectable unit），此即国际单位（IU）的来源。因此，IU本身是与拷贝没有直接关系的，当要说1 IU/ml等于多少拷贝/ml时，一定是特指某个在国际标准物质出现前采用拷贝/ml为单位的特定厂家试剂方法或检测系统而言。同样，国内厂家以前也是采用拷贝/ml来报告结果的，HBV DNA国际标准物质出来后，为保证不同厂家试剂盒之间的结果可比性，要求都采用IU/ml，所以也出现了换算，但国内厂家基本上均采用1:1的方式，这缺乏严谨性，如果当初的厂家的拷贝/ml溯源的源头（厂家参考物质）一直保持不变的话，两者的换算不可能是1:1的。

2. HBV DNA定量检测试剂的检测灵敏度

　　HBV DNA定量检测在国内均采用实时荧光PCR技术，国外也主要采用这种方法，检测敏感性可达10 IU/ml左右。抗病毒治疗的首要目标是持久抑制HBV复制，尽可能使血清中的HBV DNA降至最低水平。因此，要求在乙型肝炎的抗病毒药物治疗过程，一是要采用HBV DNA定量检测确定抗病毒治疗前患者的基线HBV DNA水平，监测对抗病毒治疗的应答和监视抗病毒药物的耐药情况。二是要求所使用的测定方法要有足够的检测灵敏度。国内的HBV DNA实时荧光PCR方法的检测灵敏度通常都在500-1,000 IU/ml，并且批内批间结果变异也较大，表面看起来，似乎是国内的实时荧光PCR方法不行，但实际上并非如此，单从实时荧光PCR这个环节，国内试剂盒与国外试剂盒是没有什么区别的，造成结果差异的关键原因是核酸提取环节以及后续扩增检测时样本的加入量和反应体积，国内试剂盒为了简化操作，以前通常并不进行完全的核酸提取，只是简单的裂解及煮沸，离心后，取上清2-5μl用于扩增。这样用于扩增的样本内可能会含有血红蛋白、IgG等PCR抑制剂，使得只能取少量样本（2-5μl）进行扩增，进而由于极微量加样的重复性显然较量大时差，检测的重复性亦差，同时，因为标本量及扩增加样量均较小，检测的敏感性自然也不行。反之，进口试剂均有对标本的核酸纯化提取，标本的用量大（500μl或850μl），核酸纯化后用于扩增的样本量亦大（50μl），于是测定的敏感性和重复性均远好于国内试剂。如果采用磁珠进行核酸纯化，并加大样本量，其后无需改变扩增试剂组成，只需按样本量成比例即可，试剂盒的检测灵敏度及重复性等均与国外同类试剂盒相近。

来源：检验视界网　　作者：卫生部临床检验中心李金明