4.分析特异性
4.1交叉反应
申请人应针对可在人类生殖道寄生或经性传播的病原体等进行交叉反应验证,用于交叉反应验证的样品,除特别说明外应尽量采用灭活病原体培养物或临床样本。建议在病毒和细菌感染的医学相关水平进行交叉反应的验证,通常,细菌感染的水平为106 CFU/mL或更高,病毒为105 PFU/mL或更高。申请人应详细说明交叉反应样本来源、病原体鉴定和滴度确定的方法和结果。病原体种类主要考虑以下几方面:预期用途不包含的其他基因型HPV(可采用人工克隆或合成的HPV DNA质粒或RNA)、人类生殖道寄生或可经性传播的其他病原体、其他常见病原体。(详见表1)
此外,申请人应针对被检测靶序列进行基因序列比对,并提交比对结果,如有同源性序列则应进行交叉反应验证。
表1 用于交叉反应性研究的病原体(其中标记*的项目为必做项目,其他为推荐项目,申请人可根据自身的情况决定是否还需其他交叉反应的验证)
*其他HPV型别(6、11、16、18、26、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、54、56、58、59、61、66、68、72、73、81、82等) | *单纯疱疹病毒Ⅱ型 | *梅毒螺旋体 | *解脲支原体 | *人型支原体 | *淋病奈瑟菌(淋球菌) | *白色念珠菌 | * **毛滴虫 | *沙眼衣原体 | **棒状杆菌 | 短小棒状杆菌 | 鲍曼不动杆菌 | 耻垢分枝杆菌 | 脆弱类杆菌 | 阴沟肠杆菌 | 粪肠球菌 | 大肠杆菌 | 金黄色葡萄球菌 | 表皮葡萄球菌 | 甲型链球菌 | 乙型肝炎病毒 | 丙型肝炎病毒 | HIV病毒 | EB病毒 | 巨细胞病毒 | 单纯疱疹病毒Ⅰ型 |
4.2干扰试验 应根据所采集样本类型,进行干扰物质验证。建议申请人在每种干扰物质的潜在最大浓度(“最差条件”)条件下进行评价,并至少采用两个浓度水平样品进行干扰试验验证,其中包含临床决定水平。干扰物质的选取应包括:血红蛋白、白细胞、宫颈粘液等。 5.精密度 企业应对精密度指标,如标准差或变异系数等的评价标准做出合理要求。鉴于HPV病毒尚不能体外培养,因此可以采用体外克隆或人工合成的HPV DNA 质粒(或RNA)代替;但模拟样本并不能体现临床样本可能带来的所有变异因素,因此精密度评价中应同时包含若干临床样本,且精密度评价试验应包含核酸分离/纯化步骤。针对本类产品的精密度评价主要包括以下要求。 (1)对可能影响检测精密度的主要变量进行验证,除检测试剂(包括核酸分离/纯化组分)本身的影响外,还应对分析仪、操作者、地点、检测轮次等要素进行相关的验证。 (2)合理的精密度评价周期,例如:为期至少20天的连续检测,每天至少由2人完成不少于2次的完整检测,从而对批内/批间、日内/日间以及不同操作者之间的精密度进行综合评价。如有条件,申请人应选择不同的实验室进行重复试验以对室间精密度进行评价。 (3)用于精密度评价的人工模拟样品和临床样本均应至少包含3个水平:阴性样品、临界阳性样品、(中或强)阳性样品,并根据产品特性设定适当的精密度要求,其中临床样本精密度评价中的每一次检测均应从核酸提取开始。 企业设置的精密度参考品可仅采用模拟样品,且可以仅包含常见HPV基因型,但每个反应体系(管)均应设置精密度参考品,并至少设置一个弱阳性水平。 (五)阳性判断值确定资料 对于此类试剂,阳性判断值即为能够获得理想的临床灵敏度和临床特异性的临界值(Cutoff),对于荧光探针PCR方法即为Ct值的确定资料,对于PCR-点杂交法即为最低检测限(LoD)。建议采用受试者工作特征(ROC)曲线的方式进行相关研究。申请人可选取适当的临床样本进行初步试验以确定阳性判断值,并在后续临床试验中确认其适用性,亦可将此研究纳入下文所述的有关ASC-US人群分流的临床试验中;无论采用何种方式均应明确样本入组标准,并说明实验方案及其合理性。 (六)稳定性研究资料 稳定性研究资料主要涉及两部分内容,申报试剂的稳定性和适用样本的稳定性研究。前者主要包括至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的实时稳定性研究,以及试剂开瓶稳定性、复溶稳定性、运输稳定性及冻融次数限制等研究。后者则是指适用样本的保存条件、保存时间等方面的研究,如样本采集方法不同,则需分别完成稳定性研究。对于此类试剂,如核酸提取液不一定立即进行检测,则还需对核酸提取液的保存条件和稳定性进行研究,如样本保存液不同,亦需分别完成稳定性研究。 在稳定性研究中,应选择适当的温度范围,在多个时间点进行评价,申请人应提交有关稳定性研究方案的确定依据、具体的试验方法及详细的研究数据、结论。 试剂稳定性和样本稳定性两部分内容的研究结果均应在说明书【储存条件及有效期】和【样本要求】两项中进行详细说明。
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