病毒学报2015年第1期文章摘要节选

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戊型肝炎病毒高通量中和效价评价模型的建立
杨帆;唐自闽;王思令;蔡薇;温桂平;纪文芳;余静菲;张可;夏宁邵;郑子峥;
广泛有效的体外感染模型的缺乏限制了抗戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)抗体及血清定量化中和效价的评估,从而阻碍了对HEV相关抗体应答及免疫机制的深入研究。本研究首先通过在HEV低效复制细胞系HepG2肝癌细胞株上进行了HEV感染细胞后的连续监测,直到第13d到达病毒载量的检测下限,验证了该细胞系建立感染模型的可行性,进一步采用96孔多通道平行感染、核酸提取及实时荧光定量PCR对五株抗HEV的鼠源单克隆抗体及四位戊肝疫苗接种者的接种前、后血清样本进行了细胞中和试验。结果显示应用该模型能够实现对不同中和能力的单抗及接种疫苗前后的血清进行中和效价的定量化评估。表明本研究已成功建立了HEV体外高通量中和评价模型,同时也显示出该模型在HEV疫苗及抗体应答表位研究中所具有的潜在价值。

表达丙型肝炎病毒(HCV)截短型NS3与core融合抗原的重组腺病毒疫苗在小鼠中的免疫原性与保护效果分析
管洁;邓瑶;陈红;杨扬;文波;谭文杰;
为研发安全广谱有效的丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)T细胞疫苗,本研究构建了表达HCV截短型非结构蛋白3(Nonstructural protein 3,NS3)与核心蛋白(core)融合抗原的重组腺病毒疫苗。体外免疫荧光及蛋白印迹实验表明该融合抗原可有效表达;小鼠免疫结果表明该重组腺病毒疫苗除了激发抗原特异的抗体反应外,还可激发较强的针对NS3抗原特异的T细胞免疫应答。该T细胞免疫应答主要表现为IFN-γ+与TNF-α+CD4+T细胞亚群。采用异型(JFH1,2a型)HCV重组痘病毒接种小鼠进行保护效果分析,与对照组相比,表达截短型NS3与core融合抗原的重组腺病毒疫苗2针免疫后可产生明显的交叉免疫保护。本研究为进一步研究HCV免疫保护机制及新型疫苗研制提供了参考。

山东省潍坊市慢性乙型肝炎患者HBVP区基因耐药突变检测及相关因素分析
赵建强;刘加法;
探讨慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)患者多聚酶基因逆转录保守区(P区)位点突变情况。选择212例行核苷(酸)类似物抗病毒治疗的CHB患者,采用PCR产物直接测序法检测HBV P基因区耐药变异位点,同时检测其HBV基因型。结果表明,HBV的P基因区突变位点有173、180、18l、184、204、236和250,主要的耐药位点为204和180,分别占35.8%和23.5%。180位点在不同年龄组之间比较均有显著差异,204位点在30岁以下组与41~50岁组、51~60岁组间比较有显著差异(P<0.05,P<0.01);180位点联合204位点突变率为66.6%,l81位点联合236位点突变率为23.3%;HBV C基因型患者年龄明显大于B基因型患者(P<0.01)。M204V/I多以联合L180M突变的形式存在,突变率与年龄有关,HBV基因型和HBV P区耐药位点的检测对CHB患者的治疗和病情预后具有重要的临床意义。



抗发热伴血小板减少综合征病毒结构蛋白单克隆抗体的制备和功能分析
李阿茜;刘林;张硕;李川;张全福;梁米芳;李德新;
为制备抗发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus,SFTSV)结构蛋白的单克隆抗体,本研究用灭活纯化的SFTSV病毒颗粒免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术获得分别分泌抗糖蛋白单抗和核蛋白单抗的杂交瘤细胞株。用免疫荧光法和免疫沉淀方法对制备的单克隆抗体的抗原特异性进行鉴定,并初步进行单抗效价、中和活性及亲和力等功能分析。结果显示,通过细胞融合和克隆化,共筛选出13株稳定分泌抗糖蛋白(Glycoprotein,GP)单抗和7株稳定分泌抗核蛋白(Nucleoprotein,NP)单抗的杂交瘤细胞株。免疫荧光和免疫沉淀鉴定显示获得的单抗有良好的抗原特异性。抗GP单抗中6株针对Gn,7株针对Gc,大部分的间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay,IFA)滴度在1 280~20 480之间,其中4株抗Gn单抗具有中和活性。获得的7株抗NP单抗均与NP特异性结合,IFA滴度范围在5 120~20 480,均无中和活性。此外,经非竞争ELISA检测的两株抗GP单抗(1C8和1G8)均有较高亲和力。本研究为SFTS诊断方法的发展及SFTSV致病机制研究奠定了基础。


人源抗发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒-Gn蛋白重组抗体的研究
陈素华;孙丽娜;刘洋;李川;刘林;梁米芳;仇佩虹;
为研制人源抗发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)Gn蛋白重组抗体,本研究利用噬菌体表面展示技术,以SFTSV全病毒颗粒和重组表达SFTSV-Gn蛋白为抗原,从人源抗SFTSV Fab噬菌体抗体库中筛选抗SFTSV-Gn蛋白的重组Fab抗体,通过ELISA对Fab抗体的结合特异性进行检测。将Fab抗体基因克隆入哺乳动物细胞表达载体HL51-14,瞬时转染293T细胞获得分泌表达的IgG抗体。通过ELISA、IFA和Western-blotting检测IgG抗体的结合特异性。采用亲和层析纯化IgG抗体,并用微量中和试验检测IgG抗体的中和活性。结果表明经过三轮富集筛选,以SFTSV病毒颗粒为抗原筛选出364株针对SFTS病毒核蛋白Fab抗体,没有筛选出特异性结合Gn蛋白的阳性克隆,而通过Gn蛋白筛选得到8株特异结合Gn蛋白的Fab抗体,其中5株来自Lambda库,3株来自Kappa库。ELISA、IFA和Western-blotting检测证实这8株IgG抗体均能特异性结合Gn蛋白。微量中和试验显示8株新筛抗体没有中和活性,但仍可为后续SFTSV人源单克隆抗体的研究提供借鉴和参考。


2013～2014年度中国H3N2亚型流感病毒病原学特征分析
李希妍;成艳辉;谭敏菊;黄维娟;郭俊峰;隗合江;肖宁;蓝雨;赵翔;杨磊;王钊;王大燕;舒跃龙;
为分析2013~2014流感监测年度中国大陆地区H3N2亚型流感病毒的抗原性和基因变异情况,本文选择了本监测年度中国分离的H3N2亚型流感病毒,利用标准雪貂抗血清进行抗原性分析,利用Sanger测序法进行病毒基因测序,采用邻位相临法(Neighbor-Joining,N-J)方法进行种系进化分析,分析我国H3N2亚型流感病毒的变异情况,进一步比较其与疫苗株的匹配性。抗原分析显示,本监测年度H3N2亚型流感病毒大部分为疫苗株A/Victoria/361/2011细胞株的类似株(99.6%),但以A/Texas/50/2012鸡胚株为参考抗原,只有15.1%为类似株,仅有11.9%与中国流行株的鸡胚分离株A/Shanghai-Changning/1507/2012抗原性类似。HA基因特性分析显示我国毒株均位于同一大分支,NA基因没有发现与耐药性相关的氨基酸位点突变。总之,2013~2014流感监测年度我国H3N2亚型流感病毒在流行过程中未发生明显变异,但病毒在鸡胚中传代会导致关键氨基酸位点变异。应及时分析并发现我国病毒的抗原性和基因特性变异情况,推选出更适合我国的疫苗株。


病毒性脑炎病例中埃可病毒11型病毒的基因特征分析
陈前进;曹春远;张彦锋;何春荣;罗招福;何云;廖亦红;吴水新;
分析埃可病毒11型(Echovirus 11,ECHO 11)福建龙岩分离株的分子生物学特征。收集龙岩市第一医院2011年1~12月临床诊断为病毒性脑炎或中枢神经系统感染的住院病例脑脊液标本进行病毒分离鉴定,从7株经血清中和鉴定的ECHO 11分离株中,选取4株测定VP1完整编码区序列,与GenBank上已发表的ECHO 11型病毒VP1区进行同源性比较及遗传进化分析。4株ECHO 11分离株VPl区序列长度为600个核苷酸,编码200个氨基酸;4株之间的核苷酸同源性为100%,氨基酸同源性为99%~100%;与1953年Gregory原型株之间的核苷酸同源性为75%~76%,氨基酸同源性为90%;与2007年荷兰株(GU393773)之间核苷酸的同源性为94%~95%,氨基酸同源性为98%~99%,同源性最高;与国内2010年山东株之间核苷酸的同源性为74%,氨基酸同源性为88%~89%。系统进化树分析显示,4株龙岩分离株同属D5型,其与D5型病毒株(GU393713)之间核苷酸的同源性为93%,氨基酸同源性为99%。国内分离株之间相对较低的相似性提示国内ECHO 11病毒可能存在不同的传播链。


从兰州急性腹泻儿童中检出人博卡病毒4型
向静瑶;马鑫;郭延青;段招军;李宇宁;李丹地;
为了解兰州地区病毒性腹泻患儿中人博卡病毒4(HBoV4)的流行情况,收集兰州大学第一医院2012年7月至2013年6月5岁以下腹泻患儿的粪便标本331份,采用巢式PCR方法检测HBoV。将HBoV阳性序列与GenBank中相关序列进行比较分析,发现1例罕见HBoV4。该株与泰国株(GenBank登录号:JQ267789)核苷酸和氨基酸的同源性为98.9%、98.7%,与美国株(GenBank登录号:GQ506568)核苷酸和氨基酸的同源性为97.6%、97.4%,为典型的HBoV4,是我国首次在腹泻患儿粪便中发现。由进化树及同源性推测HBoV4可能存在两种不同的亚型。上述结果表明,我国首次在腹泻患儿粪便中检出HBoV4,且属于HBoV4两种可能亚型中的一种亚型。


人星状病毒I型非结构蛋白nsP1a及其C末端蛋白nsP1a/4的原核表达及鉴定
刘文慧;阚丽丽;崔永胜;谭李倩;梁雪雪;李新;赵微;
人星状病毒(Human Astrovirus,HastV)是导致婴幼儿腹泻的重要病原体。HastV非结构蛋白nsP1a及C末端蛋白nsP1a/4含有各种保守的功能结构域,在星状病毒的复制、转录,病毒与宿主的相互作用中起重要作用。为获得nsP1a及其nsP1a/4蛋白,为后续蛋白相关研究提供平台,本研究在E.coli系统中进行人星状病毒非结构蛋白nsP1a及nsP1a/4蛋白的表达并对表达产物进行鉴定。首先将nsP1a及nsP1a/4基因克隆入原核表达载体PGEX-4T-1,构建nsP1a及nsP1a/4蛋白融合表达质粒;在E.coli BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,摸索两种融合蛋白表达的最优条件并对表达蛋白进行免疫印迹鉴定。结果表明nsP1a蛋白在30℃,1mM IPTG诱导12h时,蛋白表达量达到最高;nsP1a/4蛋白在20℃,0.5mM IPTG诱导8h时,蛋白表达量达到最高。Western blot结果显示两种融合蛋白既可与nsP1a蛋白免疫血清发生特异性反应,也可被GST标签抗体所识别。本研究成功利用原核系统表达并鉴定了人星状病毒非结构蛋白nsP1a及其C末端蛋白nsP1a/4,为进一步研究星状病毒非结构蛋白的功能及病毒的致病机制奠定基础。


云南蚊虫中阿卡斑病毒的分离和鉴定
冯云;何彪;付士红;杨卫红;章域震;涂长春;梁国栋;张海林;
为掌握云南省德宏州芒市和瑞丽市蚊媒病毒分布状况,2010年8月用诱蚊灯采集蚊虫17种2 149只,用金黄地鼠肾细胞(Baby hamster kidney cell,BHK-21)培养法分离病毒,阳性分离物用阿卡斑病毒(Akabane virus,AKV)S和M片段特异性引物的RT-PCR法鉴定。从采集蚊虫中分离到能引起BHK-21细胞病变和致乳小白鼠发病死亡的2株病毒,其中DHL10M110株分离自瑞丽市迷糊按蚊(Anopheles vagas),DHL10M117株分离自芒市三带喙库蚊(Culex tritaeniorhynchus)。RT-PCR扩增获得S片段的702bp序列和M片段的456bp序列,系统进化树分析表明DHL10M110和DHL10M117株与肯尼亚和澳大利亚AKV分离株进化关系较远;与日本、韩国和中国台湾的AKV分离株亲缘关系较近,但云南株形成一个独立的小分支。2株新分离病毒的S片段与中国台湾CY-77株的核苷酸(96.6%和96.7%)和氨基酸(99.6%和100%)同源性最高;M片段与日本Iriki株的核苷酸同源性最高(93.2%和93.6%),与中国台湾CY-77株氨基酸同源性最高(99.6%和100%);与肯尼亚MP496株核苷酸(69.7%和70.0%)和氨基酸(91.0%)同源性最低。本研究证实云南省德宏州存在AKV的流行,与亚洲流行株具有较近的亲缘关系。三带喙库蚊和迷糊按蚊可传播该病毒。


侵染白术的蚕豆萎蔫病毒2号的分子检测与序列分析
牛颜冰;时晓丽;张西梅;赵慧琪;赵保佳;
为鉴定引起山西绛县白术花叶、黄化等症状的病原,利用生物学接种、非序列依赖性PCR扩增(SIA)和RTPCR的研究方法,对白术病样进行了研究,结果表明:接种感病白术病汁液的指示植物昆诺藜表现退绿枯斑,经单斑分离后转接健康白术植株呈现出与病样类似的症状,初步证明白术病害可能为病毒引起的;SIA检测表明感病白术为蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus 2,BBWV2)侵染所致;为明确BBWV2白术分离物(BBWV2-Am)的分类地位,进一步克隆了BBWV2-Am RNA2外壳蛋白大亚基基因(LCP)和外壳蛋白小亚基基因(SCP)序列;序列同源性分析表明,LCP基因和SCP基因与已发表的BBWV2其它株系相应基因核苷酸序列的同源性分别为79.3%~87.2%和80.1%~89.2%,氨基酸序列同源性分别为91.2%~95.7%和89.4%~95.5%;系统进化树分析显示,BBWV2-Am与BBWV2地黄分离物(BBWV2-Rg)形成一个独立分支,二者亲缘关系最近。这是BBWV2侵染白术的首次报道。


表达猪圆环病毒2型ORF2基因的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建与鉴定
张挺杰;刘星;孙涛;朱雪蛟;范宝超;白娟;姜平;
猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)和猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是目前危害世界养猪业的两种重要病原。本研究采用PCR方法构建PRRSV疫苗株TJM-F92全长cDNA克隆载体pCMV-TJM,并在其ORF7和3′UTR之间插入AflⅡ/MluⅠ酶切位点和转录调控序列TRS6,构建获得pCMV-TJM-TRS表达载体。将PCV2ORF2基因插入该载体AflⅡ/MluⅠ位点,获得重组质粒pCMV-TJM-Cap。将pCMV-TJM、pCMV-TJM-TRS和pCMV-TJM-Cap分别转染Marc-145细胞,拯救获得3种重组病毒rTJM、rTJM/TRS和rTJM/Cap。基因测序列、酶切鉴定、Western blot、间接免疫荧光和病毒生长特性结果显示,3种重组PRRSV病毒都含有特征性分子标记,在Marc-145细胞增殖特性与亲本病毒相似;rTJM/Cap传至第8代,仍含有外源Cap基因,病毒感染细胞能有效表达PCV2Cap蛋白,从而为PRRSV致病机制和PRRSV-PCV2疫苗研究奠定了重要基础。


综述：

猫杯状病毒反向遗传学操作系统的建立及其应用的研究进展
赵艳丽;董宏伟;陈小庆;高超;刘秋艳;杨松涛;胡桂学;
猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)是引起猫呼吸道疾病的一种常见病原,自1995年以来,国内外相继建立了FCV反向遗传学操作系统并且FCV反向遗传学在病毒基因组结构与功能、表达外源蛋白、与宿主相互作用、致病机理等研究方面的应用已经取得了一些进展,本文通过收集FCV反向遗传学相关的研究文献,对FCV反向遗传学操作系统的建立及其应用研究进展进行综述,以期为相关领域的研究提供有益的参考与借鉴。


蝙蝠甲型流感病毒H17N10新亚型的研究进展
谭伟;谢芝勋;
2012年研究人员在蝙蝠中发现了甲型流感病毒H17N10新亚型。蛋白序列及结构分析显示,HA17蛋白及NA10蛋白与已知的甲型流感病毒的血凝素和神经氨酸酶不同,它们不能与唾液酸结合,表明H17N10亚型病毒的HA17蛋白及NA10蛋白可能具有新功能。本文将扼要介绍有关蝙蝠甲型流感病毒H17N10亚型的研究进展。


水貂阿留申病抗体检测技术研究及应用进展
万洪理;冯二凯;吴洪超;杨艳玲;倪佳;陈立志;
水貂阿留申病严重危害毛皮动物产业发展,其病毒中和抗体不能提供保护能力,相反可造成水貂持续性感染,迄今尚无特异的防治方法。因此世界各国主要通过抗体检测技术筛选并淘汰阳性水貂以达到阿留申病的净化清除。本文介绍了阿留申抗体检测的经典技术,常规检测技术对流免疫电泳及一些有潜在应用价值的新兴技术,并对其发展趋势做了展望。


抗病毒免疫因子Viperin的研究进展
朱春辉;汤艳东;徐方;周建华;
先天免疫因子Viperin是一种功能与内质网相关的抗病毒蛋白,可被干扰素、多种病毒、细菌脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)和poly(I:C)等诱导表达。Viperin通过与病毒蛋白和某些细胞内蛋白的相互作用抑制病毒增殖,具有广谱抗病毒活性。在与宿主相互作用的长期进化过程中,某些病毒能够抑制细胞内Viperin的表达,逃逸其抗病毒功能。除抗病毒作用外,Viperin还具有其他一些生物学功能。近年来有关Viperin的研究,特别是在其抗病毒机理方面,进展较快,本文结合自身研究体会,就其基本特性和研究状况做一介绍。


丙型肝炎病毒入胞抑制剂的研究进展
曾文婷;卢雪梅;汪洁;金小宝;朱家勇;
丙肝感染是全球性的公共卫生问题之一,目前尚无预防丙肝病毒感染的疫苗,联合应用靶向丙肝不同复制阶段的药物,即所谓的"鸡尾酒"疗法可能会有更好的疗效。丙肝病毒进入宿主细胞的过程是药物干预的重要环节,这个过程是由丙肝病毒的包膜蛋白与宿主因子作用介导的,其中病毒的包膜蛋白包括E1、E2,宿主因子包括硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate,HS)、膜蛋白CD81、B族I型清道夫受体(Scavenger receptor class B type I,SR-BI)、两种紧密连接蛋白Occludin(OCLD)和Claudin(CLDN)、低密度脂蛋白受体(Low densitity lipoprotein receptor,LDLR)、树突细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素分子(Dendritic cell-specific ICAM-3-grab-bing nonintegrin,DCSIGN)、肝/淋巴细胞特异性细胞间粘附分子-3-结合整合素分子(Liver/lymph node specific ICAM-3-grabbing integrin,L-SIGN)和转铁蛋白1受体(Transferrin receptor 1,TfR1)等。病毒的包膜蛋白和这些宿主因子都可以作为靶向丙肝入胞抑制剂的作用靶点,许多研究表明丙肝入胞抑制剂作为一种新颖和有发展前景的化合物与作用于复制阶段药物联合应用能够更有效的治疗丙肝。本文综述了自20世纪90年代以来发现的靶点和靶向丙肝病毒进入宿主细胞的化合物。

来源：病毒学报