侵袭性真菌感染的实验室诊断

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作者：第二军医大学附属长征医院皮肤科  廖万清

真菌属于真核生物, 广泛分布于自然界, 绝大多数对人类有利, 少数可感染人类导致严重疾病。近30年来, 随着实体器官及造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)等技术的广泛开展、免疫抑制剂的大量应用、导管介入及留置技术的广泛开展及人类免疫缺陷病毒(HIV)在全球的持续蔓延, 侵袭性真菌感染(invasive fungal infection, IFI)的发病率及死亡率在全球范围内显著上升[1, 2], 严重威胁人类健康。目前, 国内外也有学者把IFI称为侵袭性真菌病(invasive fungal disease, IFD)[2]。流行病学研究显示, 以白假丝酵母菌为主的酵母样真菌与以烟曲霉为主的丝状真菌是IFI最常见的致病真菌; 器官移植受者真菌感染的发病率为20%~40%, 获得性免疫缺陷综合征(AIDS)患者并发真菌感染的可能性高达90%; 在美国, 酵母菌血症已跃居院内血源性感染的第4位, 而在中国IFI已成为院内感染第2位的重要组成[2~6]。IFI起病隐匿、预后凶险, 诊断主要依赖于实验室真菌学检查; 早期、正确的诊断对治疗结果及预后非常重要; 尸检研究发现, 75%的IFI病例在生前漏诊, 而漏诊率高的主要原因是目前的IFI, 尤其是烟曲霉等丝状真菌的实验室诊断水平远不能满足临床需求[5~9]。另外, 近年来临床上很多重要病原真菌, 如白假丝酵母菌对氟康唑等抗真菌药物耐药的报道也屡见不鲜[7, 8]。因此, 如何改善IFI的实验室诊断技术水平是当前国内外真菌病研究领域的热点和迫切需要解决的问题。现对当前国内外IFI实验室诊断技术应用的现状、难点及进展作一述评。

一、当前IFI实验室诊断的现状

IFI起病隐匿, 临床表现无明显特异性且常被基础疾病所掩盖, 其诊断几乎完全依赖于实验室真菌学检查。由于近年来出现的以聚合酶链反应(PCR)为基础的分子生物学检验技术及血清学检测技术还需要进一步完善[8~10], 以形态学为基础的镜检、培养及组织病理学检查等常规检查法仍是当前国内外IFI诊断的基石和金标准, 然而其固有属性导致的费时、敏感性差、阴性结果不能排除诊断、有创伤性、对技术人员经验要求高等种种缺陷及不足使得当前IFI的实验室诊断水平远不能满足临床实际需求[7]。目前, IFI的实验室诊断方法主要包括常规检查法和特殊检查法2大类。

1. 常规检查法主要有镜检、培养及组织病理学诊断等。(1)镜检是真菌常规检查的基本方法, 包括直接镜检和染色镜检, 是最简单、直接和实用的真菌实验室诊断技术方法。其阳性结果可确定真菌感染, 但阳性率低, 阴性结果不能排除诊断, 需与培养检查结果结合才能更好地为临床服务。如在脑脊液等无菌体液中发现真菌常可明确诊断, 但在采自口腔、阴道等有菌部位的临床标本只有镜检发现大量菌丝才有诊断意义。有经验的技术人员一般可通过镜检区分酵母菌、隐球菌、毛霉菌等真菌感染; (2)培养也是真菌常规检查的基本方法, 目的是为了进一步提高对病原体检出的阳性率, 以弥补直接镜检的不足, 同时确定致病真菌的种类。培养时间一般为24周, 个别生长缓慢的真菌如组织胞浆菌则需要更久; 根据不同的真菌选择相应的培养基; 有时温度也可作为鉴定真菌种属的手段之一, 如双相真菌在不同的温度形成的菌落形态不同, 烟曲霉可在45 ℃生长等。真菌培养方法分为试管法、平皿法和玻片法(小培养), 其中试管培养是临床上最常用的培养方法之一, 主要用于临床标本分离的初代培养, 平皿培养主要用于纯菌种的培养及研究, 玻片培养则主要用于菌种鉴定。目前, 酵母样致病真菌的鉴定体系比较成熟、规范, 主要从形态学特征和生理学特征2个方面来鉴定, 国内外临床真菌实验室已普遍采用商品化的API-20C试剂盒及科玛嘉酵母菌显色培养基来鉴定酵母菌, 可以较好的满足临床需求。需要指出的是, 一些显色培养基往往对白假丝酵母菌和几种常见的酵母菌鉴定比较可靠, 而对少见菌种则需要几种方法相互验证。然而, 早期、特异地诊断病原真菌, 尤其是丝状真菌侵袭性感染一直是临床IFI实验室诊断的难点[7~10]。烟曲霉等丝状真菌的鉴定对技术人员的知识储备和经验要求高, 不仅需要熟练掌握各种病原丝状真菌的菌落形态、镜下形态和产孢方式, 具体鉴定时还需参考大量文献及专业书籍, 有时还需要花费数周时间重复多次培养才能得到正确的鉴定结果; (3)组织病理学检查对IFI的诊断具有与镜检及培养同样重要的价值[2]。根据病原真菌在组织内的表现, 可将病原真菌鉴定到属的水平, 如许多病原真菌在组织内表现为菌丝, 根据菌丝的形态, 可以将其鉴定至属的水平, 发现无色分隔、分枝的菌丝多为酵母菌或曲霉; 发现粗大、不分隔、少分枝或直角分枝的菌丝多为接合菌; 发现棕褐色菌丝多为暗色真菌。另外, 对临床组织标本采用过碘酸雪夫(PAS)染色等特殊染色结合常规苏木素伊红(HE)染色可以提高IFI的组织病理学检查阳性率。另外, IFI组织病理表现有时与其他一些疾病的组织病理表现极其相似, 往往只有在仔细研究了病理切片并发现了真菌之后才考虑到IFI的诊断, 而这时标本已被固定, 培养已不可能, 组织病理切片就成了真菌感染的主要依据, 所以临床上送病理标本的同时, 要尽可能考虑到IFI的可能, 以便同时采集标本送真菌实验室进行真菌学检查及培养鉴定。

2. 特殊检查法主要包括血清学方法和分子生物学方法。引起IFI的病原真菌主要有白假丝酵母菌、烟曲霉和隐球菌等, 常规检测方法主要有血培养和组织病理检查, 但血培养历时太长且阳性率低, 而组织病理活检特异性差, 影响正确诊断。因此, 利用真菌的抗原、抗体及代谢产物的血清学检查用于IFI的实验室检测可取得理想的效果。目前, 针对病原真菌抗原的血清学检测方法主要有隐球菌乳胶凝集试验、半乳甘露聚糖试验及1-3-β -D葡聚糖试验等[5, 10]。隐球菌乳胶凝集试验检测隐球菌荚膜多糖抗原成分, 已在临床应用近40年, 其敏感性可达99%, 是目前诊断IFI最成熟、最有价值的血清学检测方法。半乳甘露聚糖试验中的半乳甘露聚糖是曲霉菌在人体内生长时释放到循环中的一种细胞壁的多糖成分, 其主要用于侵袭性曲霉感染早期诊断及患者疗效的监测。最近, 一项侵袭性曲霉感染循证医学研究共收集分析了约4 000例患者, 在确诊及拟诊患者中, 半乳甘露聚糖试验的敏感性约为61%, 特异性为93%。总的来说, 与组织病理学检查及临床标本培养诊断侵袭性曲霉感染相比, 应用半乳甘露聚糖试验诊断侵袭性曲霉感染平均要早14 d[5]。另外, 半乳甘露聚糖试验在不同种类患者中应用价值也不同, 如对血液系统疾病并发侵袭性曲霉感染患者诊断价值较高。1-3-β -D葡聚糖试验除可检测酵母菌、曲霉菌外, 还可以检测一些少见真菌, 如镰孢菌、毛孢子菌等, 但隐球菌与接合菌侵袭性感染患者阴性。1-3-β -D葡聚糖广泛存在于各类真菌细胞壁中, 占细胞壁成分的50%以上。除隐球菌与接合菌外, 存在于所有其他真菌细胞壁中, 尤以酵母菌为高, 而其他微生物、动物及人的细胞成分及细胞外液均不含此成分。1-3-β -D葡聚糖试验的敏感性及特异性约为67%和84%, 具有快速、简便的特点, 已有商品化试剂盒出售, 在国内外IFI临床真菌学检测中应用越来越广泛。
近年来, 随着分子生物学的发展, 尤其是PCR的成熟和普及, 发展以PCR为基础的分子生物学方法检测IFI是国内外医学真菌学研究领域的热点。多种分子生物学技术如DNA随机扩增多态性分析(random amplified polymorphic DNA, RAPD)、DNA扩增性片段长度多态性分析(amplified fragment length polymorphism, AFLP)、DNA限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、rRNA基因序列分析、巢式PCR、实时PCR等都先后应用于IFI的真菌分子鉴定及分子流行病学研究, 具有特异性强、敏感性高的优点[10~14]。例如, 针对真菌rRNA基因存在着广泛的保守区域, 可作为引物的结合位点, 同时客观存在的不同区域进化水平不同, 可以用于不同分类鉴定等级研究的特点, 利用ITS1、ITS4等引物, 特异性扩增待检真菌的内转录间隔区(ITS)基因并测序, 搜索GenBank等[15]数据库比对其序列, 可以将真菌鉴定到属、种甚至变种的水平。

二、当前IFI实验室诊断的困惑

目前, 镜检、培养及组织病理学诊断仍是IFI实验室诊断的基石, 与当前发展中的检测IFI的血清学及分子生物学方法的缺陷和不成熟密不可分。例如, 针对真菌抗原的血清学检测如1-3-β -D葡聚糖实验及半乳甘露聚糖实验利用免疫学原理的基本属性使其假阳性与假阴性报告屡见不鲜[7~10], 尤其是对可疑的AIDS患者复发真菌感染, 由于AIDS患者不能消除真菌抗原, 所以即使在烟曲霉等致病真菌处于非致病态, 抗原的检测也为阳性, 成为困扰当前临床IFI诊断的一大难题。

近年来, 以PCR为代表的分子生物学技术的飞速发展似乎为快速、敏感、特异的IFI诊断开辟了一条新途径。目前, 国内外已将RAPD、AFLP、RFLP等基于普通PCR的真菌DNA指纹图谱技术应用于对侵袭性酵母菌病、隐球菌病和曲霉菌病的病原体分子检验, 在科研阶段也取得了相对满意的结果, 但其针对临床标本却敏感性不高, 且不同实验室的数据之间缺乏可比性, 限制了其在临床真菌感染检验中的推广应用。真菌ITS等核糖体基因序列分析比对等技术虽然从理论上非常理想可靠, 是解决IFI诊断的分子检测理想技术之一, 近年来国内外也已广泛应用于真菌的分子鉴定及分子流行病学研究, 但其操作程序复杂、需要设备多且临床体液标本中的致病真菌DNA含量往往不能满足PCR检测需要, 目前尚无比较成熟的商品化系统能够全面完成该检测工作[16]。而虽然巢式PCR 、逆转录PCR等新一代PCR可以显著提高真菌ITS等核糖体基因序列分析比对技术的敏感性和实际应用价值, 但胃肠道死亡细胞的污染可能导致PCR 假阳性、对一些体液标本PCR分子检测还难以达到同培养的敏感性[17, 18]等不足, 使得IFI的分子检测如同本期“ 真菌感染实验室诊断及其临床应用” 专题中刊登的“ 真菌分子诊断技术的问题” 所述, 目前从临床标本的选择和处理到PCR检测后的分析等诸多环节都存在着各种各样的影响因素, 临床标本的采集与处理、PCR反应体系及PCR结果的评估均需要国内外真菌检验研究者们进行优化、标准化, 以使我们能够早日迎来IFI分子诊断时代。因此, 目前美国食品药品监督管理局还没有批准应用于临床的PCR真菌诊断方法[18]。

三、当前IFI实验室诊断的展望

正如本期专题刊登的“ 利用BIOFOSUN系统鉴定常见曲霉” 及“ 改良选择性培养基在侵袭性真菌感染诊断中的探讨” 所述, 对现有的镜检、培养及组织病理学诊断等IFI常规检测法进行完善, 是快速提高目前IFI实验室诊断水平的现实和可靠的途径。实际上, 自然界中遍布曲霉等真菌的孢子, 某些真菌如曲霉等可以在正常人及免疫抑制患者体内如呼吸道等组织中定植而并不处于侵袭性致病态。因此, 如何早期、特异的区分高危人群人体组织中处于定植及致病态的丝状真菌是IFI早期特异性诊断的真正难点。我们认为, 基于免疫学基本原理的真菌血清学检测技术对于解决该难点显然还有很大的发展空间。例如, 利用目前先进的蛋白质组学等组学技术分析真菌在人体中定植态与致病态表达蛋白产物或代谢产物的差异, 发现真菌由定植态向侵袭态转变的规律性的、新的分子标志物对于解决IFI早期特异性诊断水平意义重大。而以PCR为代表的分子生物学技术还需进一步完善, 但PCR的固有属性使其不能完全替代培养等常规检查法。

总之, 立足并不断改良现有真菌常规检查法、血清学方法及高分辨率计算机断层扫描(CT)等先进影像学技术是提高目前IFI实验室诊断水平的最佳途径, 并在此基础上不断完善现有真菌常规检查方法、完善现有及开发新型的血清学与分子生物学检测方法, IFI的实验室诊断水平一定能在不久的将来有很大提高, 满足临床的实际需求!

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